红霉素异源合成中的网络互作研究及高效合成系统的设计

聚酮类化合物的异源生物合成是目前合成生物学领域中研究较为深入、进展迅速的一个分支。尽管在过去的十年中，以红霉素为代表的聚酮类化合物在大肠杆菌中的异源合成取得了一系列重大的进展，解决了诸如关键酶修饰、前体途径重建、活性产物修饰等一系列问题，并在大肠杆菌中成功的合成了红霉素A，但仍存在着许多问题：如与原产株红霉糖多胞菌相比，红霉素在大肠杆菌中的产量过低（目前红霉素A仅为毫克级），仅有少于10%的前体参与了聚酮体的合成。这些都与异源合成途径与底盘细胞代谢网络之间的互相作用有关，充分了解这一过程，是设计更高效的红霉素异源合成系统的关键。本课题将以系统生物学的研究手段解析红霉素异源合成中的网络互作与调控规律，并籍此对大肠杆菌的全局网络进行重新设计和改造，获取更高效的红霉素异源合成系统。本研究提供了一种通用的研究策略，对高效异源合成体系的设计与优化将提供原理性支持。

聚酮类化合物的异源生物合成是目前合成生物学领域中研究较为深入、进展迅速的一个分支。尽管在过去的十年中，以红霉素为代表的聚酮类化合物在大肠杆菌中的异源合成取得了一系列重大的进展，但仍存在着许多问题：如与原产株红霉糖多胞菌相比，红霉素在大肠杆菌中的产量过低（目前红霉素A仅为毫克级），仅有少于10%的前体参与了聚酮体的合成。本课题以大肠杆菌为红霉素异源合成的底盘细胞，从全局代谢网络分析与改造、细胞的转运模块等方面，对高效异源合成6-脱氧红霉内酯B的E. coli系统进行了研究。在天然产物合成生物学中，异源模块的导入往往与宿主内源各模块间产生“适配性差”等兼容问题，从而影响目标化合物产率的提升。因此，如何快速评估和优化适配性差的模块是一项充满挑战的工作。本研究提出了一种描述模块相互作用的系统方法，并用于改善大肠杆菌异源合成红霉素关键中间体6-脱氧红霉内酯B（6dEB）中存在的模块适配问题。通过结合流量组模拟分析和转录组分析，该研究首次发现了6dEB合成过程中不同代谢模块内流量变化的整体趋势存在巨大差异。对这些差异进行系统分析后找到了改善6dEB生物合成的潜在遗传改造靶点。随后，利用反义RNA技术首次对大肠杆菌磷酸戊糖途径模块及核苷酸代谢模块上的25个预测靶点进行改造以提高6dEB的合成水平。结果显示，单独下调18个基因靶点的表达分别使6dEB的产率提升20%以上。而模块间的靶点组合改造则提升了60%以上，如anti-guaB/anti-zwf使6dEB的合成水平提升了296.2%，摇瓶发酵的产量达到了210.4 mg/L，这是目前6dEB在大肠杆菌中异源合成的最高水平。该研究提供了一种有效的方法用于提高目标产物在底盘细胞中的异源合成产率，且展示了反义RNA技术在代谢工程中具有良好的应用效果。. 本研究通过转运蛋白工程，对不同来源的细菌三组分多重耐药泵系统进行了工程化设计和改造。改造后的转运模块消除了异源产物积累对底盘细胞产生的不利影响。实验结果表明，同时强化MacA-MacB或者完整耐药泵MacAB-TolC、MdtEF-TolC能显著提高6-dEB的产量，其产量提高率分别为100±11%、118±54%；98±12%。强化耐药泵转录激活因子强化RpoH和EvgA可以使6-dEB产量分别提高152±54%、142±85%。