丙烷脒抑制灰葡萄孢霉线粒体复合酶Ⅲ的分子靶标研究

Propamidine is an alkylamidine fungicide with independent property rights and commercialization. It exhibited good antifungal activity against Botrytis cinerea, but its molecular target is unknown. Our research group conducted a preliminary study on the antifungal mechanism of propamidine under the support of the National Natural Science Foundation in 2008. It was found that the respiration rate and the activity of mitochondrial complex III decreased significantly in mycelia, and it was preliminarily clear that the inhibition of gene expression correlated with mitochondrial complex Ⅲ might be the main reason of its antifungal mechanism. Based on the results above, we plan to obtain the target gene with significantly different expression in mitochondrial complex Ⅲ after treated with propamidine by qRt-PCR method; study the interaction between target protein and propamidine by prokaryotic expression and ITC (Isothermal Titration Calorimetry); research the binding point by homology modeling and molecular docking, then identify the binding point by point mutation in vitro. These studies will contribute to the understanding of molecular target of propamidine, and it will provide a theoretical basis for biorational design and exploitation of new fungicides based on new drug targets.

丙烷脒是具有自主知识产权且商品化的烷基脒类杀菌剂，对灰葡萄孢霉具有良好的抑菌活性，但其具体分子靶标尚不明确。课题组于2008年在国家自然基金支持下对丙烷脒抑菌机制进行了初探，发现丙烷脒处理导致灰葡萄孢霉菌丝呼吸速率及线粒体复合酶Ⅲ活性显著下降，并初步明确丙烷脒对病原菌线粒体复合酶Ⅲ相关基因表达的抑制是其抑菌的主要原因。本项目拟在此基础上，以灰葡萄孢霉标准菌株B05.10为材料，通过丙烷脒处理及qRt-PCR方法，获得编码线粒体复合酶Ⅲ相关基因中表达差异显著的目的基因；利用原核表达与等温滴定量热法（ITC）验证丙烷脒与靶标蛋白的互作关系；通过同源模建及分子对接预测关键氨基酸结合位点，并进行体外定点突变，明确药剂与蛋白的互作位点。旨在揭示丙烷脒抑菌作用分子靶标，同时为基于新药靶的新型杀菌剂生物合理设计及创制提供理论依据。

丙烷脒是具有自主知识产权的烷基脒类杀菌剂，对灰葡萄孢菌具有良好的抑菌活性。前期生理生化指标测定结果表明，丙烷脒可能作用于线粒体复合酶Ⅲ从而抑制病原菌的呼吸作用。本研究采用原核表达、蛋白的提取分离纯化等方法，获得了线粒体复合酶ⅢC1亚基的纯化蛋白。但原核表达蛋白Cytb以包涵体的形式存在。通过等温滴定量热法（ITC）发现，丙烷脒与线粒体复合体C1亚基互作关系较弱。为了进一步揭示丙烷脒抑菌靶标，以灰葡萄孢菌标准菌株B05.10为出发菌株，通过药剂驯化获得了12株灰葡萄孢菌对丙烷脒高抗菌株，且能稳定遗传。引起杀菌剂高水平抗性一般是由于靶标基因突变所造成的。基于上述假设，对高抗菌株进行全基因组重测序，发现12株高抗菌株有9个共有的位于外显子区域的非同义单点突变基因，且其中的1个共有突变发生在谷氨酸脱氢酶（GDH），而Cytb基因和琥珀酸脱氢酶相关基因均未发生突变。GDH为线粒体酶，在线粒体呼吸及能量生成中发挥重要作用。此外，交互抗药性测定结果表明，丙烷脒与吡唑醚菌酯存在微弱的交互抗药性，与氟硅唑存在微弱的负交互抗药性。基于前期的生理生化指标，推测丙烷脒虽然影响病原菌呼吸作用，但其并不直接作用于复合酶Ⅲ，对复合酶Ⅲ的影响可能是其抑菌作用产生的后效应，其抑菌靶标独特。负交互抗药性在生产实践中具有重要意义。因此，将丙烷脒与氟硅唑进行复配，发现他们在不同配比下均具有相加作用，特别是在1:1配比下存在显著的增效作用。相关内容已获批国家发明专利1项。上述研究结论为进一步揭示丙烷脒抑菌机制提供了可靠的实验材料和重要的理论支撑。