拟南芥硝态氮调控基因的克隆与功能鉴定

利用由一个硝酸顺式元件、增强子片段和YFP构建而成的硝酸调控突变体筛选系统进行不同供氮条件下突变体的筛选，对目前筛选出来的两个突变体进行基因克隆，并通过互补表达加以验证；对突变体及其等位基因系和过量表达系从形态、生理和分子水平进行系统深入的鉴定分析；研究基因在植株不同部位的表达模式、受不同营养元素的调控情况和在已知硝酸调控基因突变体中的表达，并进行基因蛋白的亚细胞定位和突变体的microarray分析。本项目旨在筛选出不同类型的硝酸调控突变体，克隆出两个突变体相对应的基因，研究其功能和分子机理。为解析硝酸代谢的途径及其分子网络提供参考，为作物的高氮效利用提供理论依据。

氮素是植物所必需的大量元素，直接影响植物生长发育。研究植物对氮素的吸收利用规律，对于提高作物的氮素利用率、减少环境污染具有重要意义。本研究通过正向遗传学的方法发现一个新的突变体，在受硝酸诱导后，其响应硝态氮信号明显比野生型弱。利用图位克隆的方法克隆出突变基因，并将该基因命名为NRG2。在nrg2突变体中受硝酸诱导基因的诱导量显著低于野生型，表明NRG2是一个新的硝态氮调控基因。nrg2突变体根中的硝态氮含量较野生型低，而地上部硝态氮含量与野生型没有明显差别。进一步研究发现这是由于NRT1.1表达量降低、NRT1.8表达增加造成的。另外经分子和遗传学分析发现NRG2位于NRT1.1基因的上游并调控NRT1.1的表达。本研究还发现NRG2与NLP7在细胞核中具有互作关系，并且在nrg2突变体中，NLP7受NO3-诱导的入核过程并不受影响。转录组分析结果也证明在nrg2突变体中与硝态氮转运、响应有关的一些基因的表达都发生改变。另外在与nrt1.1突变体中受NO3-诱导基因cluster比较中发现，NRG2与NRT1.1这两个基因共同调控的与氮素有关的下游基因数量较多，进一步证明了NRG2与NRT1.1在同一条通路中对硝态氮进行调控。综上，我们发现并克隆一个新的硝态氮调控基因NRG2，它参与了硝态氮的吸收及转运，在硝态氮信号途径中作用于NRT1.1的上游，与NLP7共同调控了植物对硝态氮的响应。.利用正向遗传学我们还找到另一个新的突变体Mut65，在含有硝态氮的培养基中，其荧光表型明显比野生型弱。利用图位克隆方法克隆出了突变基因为ZHL。该基因有两种剪切形式。互补实验证明长的ZHL蛋白可以互补突变体表型。另外zhl-2突变体的硝态氮含量较野生型低，经进一步研究发现，突变体中部分转运基因表达量降低，NR活性升高。另外研究表明ZHL可以调控部分已知的硝酸调控基因（NRT1.1, CIPK8,and CIPK23），而对zhl nrt1.1双突变体的遗传分析证明zhl位于NRT1.1基因的上游并调控NRT1.1的表达。本实验还发现ZHL与NLP7对硝态氮调控具有叠加效应。转录组分析结果证明在zhl-2突变体中与氮有关的几类基因都发生改变。这些结果都说明的ZHL对硝态氮的响应具有重要作用。以上的研究结果对于建立和丰富硝态氮调控的分子网络、阐明植物对氮素的调控机制具有重要的促进作用。