新型寡核苷酸化学合成方法的研究

Chemical methods of oligonucleotide synthesis have experienced a long-term development and at present the classical methods include column-based synthesis developed in the 80s and microarray-based high throughput synthesis developed in the 90s. However, most of these methods are based on the traditional phosphoramide chemical synthesis. Besides, because every step of the chemical reactions is incomplete and with possible side reactions, the synthetic error rate rises sharply with the extension of chain. Under current circumstance, the commercial.companies can provide long chain oligonucleotides with up to about 150-200 nt, and the corresponding error rate can only be stable at about 0.2 %. It is still much challenging to synthesize longer chain (for example, 250 nt) with low error rate. Therefore, a new generation of synthetic technology is urgently desirable to realize oligonucleotide synthesis with long chain and low error rate. In order to solve the existing problems of low efficiency, high cost, and high error rate, the project focus on developing a new generation of chemical synthesis technology research through the breakthrough of traditional phosphoramide chemical synthesis strategy, the integration of a single cycle steps, etc., including but not limited to light generating acid synthesis, dimer synthesis, two steps synthesis, P(Ⅴ) synthesis etc. to realize oligonucleotide synthesis with long bases, low error rate, and low cost.

寡核苷酸的化学合成方法经历了长期的发展，目前经典的方法包括八十年代发展起来的柱式合成，以及九十年代发展起来的基于微阵列的高通量合成。这些方法大多都基于传统亚磷酰胺化学法，由于每一步反应的不完全性和伴随可能的副反应，随着链的延长，合成错误率急剧上升。在目前比较成熟的方案下，商业化的寡核苷酸链长仅能达到150-200 nt左右，相应的错误率也仅能稳定在0.2%左右，而要合成更长的链长，例如250 nt，又要保证低错误率，仍然是很大的挑战。因此，亟需开发新一代合成技术，实现长链，低错误率。针对目前存在合成效率低、成本高、错误率高的问题，本项目重点开展新一代化学合成技术研究，通过对传统亚磷酰胺化学合成策略的突破，单个循环步骤的整合等方面，分别形成一系列创新性的化学法合成技术，包括但不仅限于光制酸脱保护法、双碱基合成法、二步法合成、五价磷合成法等，实现寡核苷酸合成的长碱基、低错误率、低成本合成

寡核苷酸在基因编辑、基因检测、基因治疗、合成生物学等领域有着极为广阔的应用前景。目前主流的寡核苷酸合成大多都基于传统的亚磷酰胺化学法，由于每一步反应的不完全性和伴随可能的副反应，随着链的延长，合成错误率急剧上升。成熟商业化的寡核苷酸合成链长最长能达到200 nt，相应的合成错误率也仅能稳定在0.2%左右，而要在合成更长的链长的同时，又要保证低错误率，仍然是寡核苷酸合成领域很大的挑战。因此，亟需开发新的合成方法，实现高效率、低错误率的长单链寡核苷酸（long single-stranded DNA，lssDNA）合成。.针对目前传统寡核苷酸合成方法存在难以突破200 nt合成，错误率高的问题，本项目开发了2种全新的lssDNA合成方法：1）基于双碱基单体的lssDNA合成方法，实现了＞200 nt的lssDNA合成，且合成效率与传统单碱基合成相当，并在重复序列合成时有一定的优势；2）基于固相载体的lssDNA合成方法，主要研究了该方法的可行性，系统优化了其合成流程，最终实现寡核苷酸合成链长＞300 nt，经过胶图表征确认合成长度，进一步通过基因测序验证统计其单碱基合成错误率＜0.1%，并用该方法合成的7条300 nt-400 nt的lssDNA粗产物一次性组装成2 Kb的基因片段，实现了该方法在基因合成方向的应用验证。此外，与其它lssDNA合成方法及商业化订购产物相比有着简便、高效、错误率低的优点。另外积极与各相关课题组合作交流，开展基于核酸合成的基础研究和化学合成方法学研究，进行一些应用层面的尝试和前期探索，并取得了一定的成果。.最后，本项目成功建立了两种全新的高合成效率、低错误率的lssDNA合成方法，为lssDNA的合成方法开发提供了新的思路，有一定的实用价值和商业化可能性，并一定程度上促进了lssDNA的进一步广泛应用。