嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控细胞凋亡的分子机制研究

Type Fourth Secretion System(T4SS) from Anaplasma phagocytophilum plays pivotal roles in regulating host cells apoptosis and promoting pathogen intracellular propagation and survives. The recent research demonstrated that effector Ats-1 inhibited mitochondrial-mediating apoptotic pathway, but the specific mechanism remains unclear. In this study, we will analyze and verificate host protein difference expression profile and apoptosis related proteins regulated by Ats-1 through transfection, isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and bioinformatics; Screening host targets interaction with LGAS1、TIMP1 by yeast two hybride,yeast co-transformation and IP;The relations between the apoptosis related difference proteins and apoptosis pathway would further analyzed through RNA inference, pathogen infection, quantitative real-time PCR, Western Blot flow cytometry and so on. The molecular mechanism and singnal pathway of apoptosis regulated by Ats-1, and LGAS1,TIMP1 interaction with Ats-1 was intensive illuminate. These works will be useful for us find novel therapeutic targets, develop new preventive vaccines and take some clues for HGA control.

嗜吞噬无形体四型分泌系统(T4SS)在调控宿主细胞凋亡和促胞内生存过程中发挥重要作用。已有研究表明T4SS效应蛋白Ats-1抑制线粒体介导细胞凋亡，但具体机制尚未阐明。本项目以效应蛋白Ats-1为切入点，利用转染、iTRAQ和生物信息学等技术，分析受Ats-1调控的宿主蛋白差异表达谱，筛选与细胞凋亡相关蛋白；利用酵母双杂交、酵母共转化和免疫沉淀等筛选验证与LGAS1、TIMP1互作的宿主细胞靶蛋白；基于上述实验结果，进行生物信息分析，寻找受Ats-1调控的细胞凋亡相关关键蛋白，利用RNA干扰、细菌侵染、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印记及流式细胞术等技术，验证并揭示这些细胞凋亡相关关键蛋白与细胞凋亡信号通路关系，分析阐明效应蛋白Ats-1及其互作蛋白LGAS1、TIMP1参与的细胞凋亡信号通路及调控的分子机制。这将为开发新药物治疗靶标、新疫苗及人兽共患无无形体病防控提供科学依据。

嗜吞噬无形体（Anaplasma phagocytophilum，APH）感染引起的无形体病严重影响人类和动物健康。前期研究发现，无形体效应蛋白 Ats-1 易位到宿主细胞后与细胞凋亡有关，但调控细胞凋亡的分子机制不清楚。本项目开展的主要科研内容如下：.1. 利用iTRAQ技术，筛选受Ats-1 调控的细胞凋亡相关蛋白.构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ats-1及细胞转染模型，Western blot验证Ats-1在宿主细胞中正确表达；利用iTRAQ 、PRM 和靶向代谢组学分析、验证受Ats-1调控的细胞蛋白主要集中于线粒体中； 其中表达上调的5种蛋白（NDUFB3、NDUFB5、NDUFS7、COX6C和SLC25A5）与细胞凋亡相关，同时也与TCA、氧化磷酸化、糖酵解、磷酸戊糖途径密切相关；qRT-PCR、ATP水平检测、CCK-8检测、流式细胞术证实，Ats-1表达增加了ATP的水平，抑制了细胞凋亡。.2. 筛选并验证与Ats-1互作的宿主靶蛋白及功能验证.利用酵母双杂交技术、酵母共转化、免疫共沉淀，最终筛选到一个与Ats-1互作的宿主靶蛋白SDCBP(Syntenin-1)；通过生物信息学分析、Western blot 检测实验表明，Ats-1促进SDCBP(Syntenin-1)表达上调，同时SDCBP(Syntenin-1)与外泌体生物合成及分泌有关；最后通过外泌体提取纯化、透射电镜、纳米粒子跟踪、外泌体标志物分析实验，证实Ats-1促进HEK293T细胞的外泌体分泌。.3. 结论.本项目从蛋白定量和蛋白定性两方面得出的结论是，无形体分泌蛋白Ats-1进入宿主细胞后，参与了宿主线粒体相关细胞凋亡途径，抑制细胞凋亡；同时，Ats-1与SDCBP(Syntenin-1)互作，增加了宿主细胞外泌体的分泌，最终可能有利于病原无形体在宿主细胞内的生存。