昆虫可溶型海藻糖酶（Tre-1）异源表达及与植物源抑制剂的互作研究

海藻糖酶是昆虫能量代谢的核心酶，以其作为作用靶标的海藻糖酶抑制剂研究备受关注。植物源抑制剂研究以其良好效果和低毒环保成为研究热点。前期项目首次发现2种植物源化合物对昆虫中肠可溶型海藻糖酶（Tre-1）具有很好的活体和离体抑制效果。为探索抑制机制，建立海藻糖酶高效体外表达系统来分析重组表达蛋白酶的活性是非常重要也是必不可少的，但目前关于海藻糖酶基因分离和体外异源表达研究甚少。本项目拟从昆虫中肠分离Tre-1基因，通过构建表达载体，获得有活性的体外重组Tre-1酶，并通过对重组Tre-1蛋白的活性位点进行化学修饰、催化基团pKa测定，研究该酶的结构和关键催化部位，继而采用荧光光谱方法探索植物源抑制剂同Tre-1的相互作用，明确化合物对靶标酶的抑制机制及高抑制活性化合物的结构特点，推动以昆虫海藻糖酶为靶标的新型农药开发。

海藻糖酶是昆虫能量代谢的核心酶，其催化昆虫的血糖---海藻糖分解为葡萄糖。而高等动物中的血糖为葡萄糖，因此其作为杀虫剂作用靶标的研究备受关注。本项目从棉铃虫中肠中分离了一条可溶型海藻糖酶（Tre-1）基因，从东亚飞蝗中分离出一条膜结合型海藻糖酶（Tre-2）基因。针对Tre-1成功构建了表达载体，获得具有高催化活性的上清蛋白，对该重组蛋白进行了酶学特性和动力学分析。通过对棉铃虫中肠纯化Tre-1蛋白的动力学和化学修饰确定了其活性中心的组成。抑制剂的研究主要采用动力学、化学修饰、荧光光谱分析针对昆虫活体、离体的海藻糖酶以及重组的蛋白进行研究，明确了3种分别属于不同类型抑制效果好的植物源抑制剂进行了离体和活体抑制效果，抑制类型和抑制机理研究以及不同抑制剂对Tre-1和Tre-2的抑制效果的差异。本研究还首次筛选获得一株能产生表面活性剂的伯克氏菌属微生物并已经获得国家发明专利，为研发高效低毒有选择性的天然杀虫剂奠定基础。