微孢子虫免疫逃逸柞蚕黑化包被的分子机制研究

Insect can start immune reaction induced by prostaglandins (PGs) when pathogens invade. Melanotic encapsulation is induced by nodulation of cellular immunity and melanization of humoral immunity, and it can kill pathogens by reactive oxygen species (ROS). Nosema pernyi has long live stage and offspring-vertical-transmit way through eggs in Antheraea pernyi. It is important for N. pernyi escape from immune reaction and reduces oxidative damage in order to reproduction. In the former research, a lot of antioxidative phospholipid hydroperoside glutathione peroxidast (PHGPx) and phospholipid-transporting ATPase genes were found in N. pernyi. This program will focus on phospholipase A2 (PLA2) gene in PGs process. RNAi secretory phospholipase A2 (sPLA2) or add inhibitor of PLA2, we will check the influence of melanotic encapsulation. Using different treated spores infected with A. pernyi, we will check secretory phospholipase A2 (sPLA2), inducible nitric oxide sythase (iNOS) genes’ expression after killed spores. Meanwhile, we will analyze whether PHGPx and phospholipid-transporting genes can resist melanotic encapsulation from A. pernyi. This research will understand more about how N. pernyi escape from PGs induced immune injury.

昆虫在病原物入侵时，会通过前列腺素（PGs）介导产生免疫反应。细胞免疫的成瘤反应和体液免疫的黑化作用产生黑化包被，再通过活性氧（ROS）杀灭病原物。柞蚕微孢子虫感染柞蚕时具有较长的寄生时间，并通过卵传播到子代。微孢子虫能否逃逸柞蚕的免疫反应以减少氧化损伤是繁殖传播的关键。前期研究发现柞蚕微孢子虫有大量抗氧化类磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）、磷脂转移酶基因的表达。本项目在分析柞蚕PGs生成关键基因磷脂酶（PLA2）的基础上，RNA干扰分泌型磷脂酶（sPLA2）基因或注射PLA2抑制剂，检测黑化包被的差异。通过不同处理的微孢子虫感染试验，对比灭活孢子后对PGs生成的主要调控基因sPLA2、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。同时，分析柞蚕微孢子虫PHGPx、磷脂转移酶基因是否能够在一定程度上抵抗柞蚕黑化包被。本研究为阐明微孢子虫通过影响PGs介导的免疫损伤完成逃逸的机理奠定基础。

前列腺素（PGs）属于类花生酸的一种，由磷脂通过一系列反应后生成。这类C20不饱和脂肪酸被证明与昆虫的免疫密切相关。昆虫在病原物入侵时，会通过前列腺素（PGs）介导产生免疫反应。细胞免疫的成瘤反应和体液免疫的黑化作用产生黑化包被，再通过活性氧（ROS）杀灭病原物。在PGs生成的途径中，一氧化氮合成酶（NOS）、磷脂酶（PLA2）等在中间产物花生四烯酸（AA）的生成过程中发挥重要作用。微孢子虫在感染柞蚕时，能够被免疫反应识别并减缓其对柞蚕的影响。而微粒子病表现为慢性病害，具有较长的寄生时间。有关微孢子虫逃逸黑化包被反应所涉及的分子机制尚未明确。本研究通过对PGs生成途径的关键酶类进行鉴定，获得了3个NOS基因（NOS1、NOS2和NOSIP）、2个PLA2基因（ApPLA2 XII和ApPLA2 XV），半定量和实时荧光定量结果表明在微孢子虫的寄生过程中，会诱导相关基因的表达并影响PGs含量的变化。微孢子虫的寄生会诱发柞蚕肠道内ROS（NO和H2O2）的升高。加入NOS抑制剂L-NAME或PLA2抑制剂DEX减弱了柞蚕的免疫反应，如再添加花生四烯酸AA补救则促进免疫的增强。如果采用RNAi影响PGs合成，则对下游的免疫反应产生影响，包括酚氧化酶PO和抗菌肽类（AMPs）的表达。对比微孢子虫与其他病原微生物对柞蚕侵染的黑色结节反应，微孢子虫表现出分散型黑色渣点，而已经发芽或灭活的微孢子虫受到的黑化包被的程度逐渐增高。除了PO在体液黑化反应中发挥作用外，酪氨酸羟化酶（TH）和多巴脱羧酶（DDC）也被证明发挥了重要作用。本研究中，为精准验证PGs对微孢子虫寄生率的影响，开发了一套针对柞蚕微孢子虫的高灵敏度、高通量的检测方法。鉴定了柞蚕微孢子虫3条极管蛋白和1条孢壁蛋白，制备抗体免疫共沉淀获得了与柞蚕互作的潜在蛋白。对长期寄生微孢子虫的柞蚕血淋巴进行代谢物的测定，结果显示类二十烷酸类物质相对于健康组有所降低，微孢子虫可能通过减缓柞蚕的免疫反应而达到更长时间寄生的目的。