整合素经MerTK-Src-FAK-Rac1信号通路调控肺泡巨噬细胞吞噬凋亡嗜中性粒细胞的分子机制

嗜中性粒细胞和肺泡巨噬细胞是气道炎症性疾病的主要效应细胞。我们前期研究发现肺泡巨噬细胞清除凋亡嗜中性粒细胞在气道炎症性疾病的发病中有重要作用，膜连蛋白参与此过程。最近有研究发现膜连蛋白可以结合整合素的胞浆信号区，由此我们推测：肺泡巨噬细胞通过整合素与膜连蛋白的相互作用，经MerTK-Src-FAK-Rac1募集p130cas-CrkII-Dock180复合体诱导Rac1的激活和吞噬小体的形成，从而完成吞噬过程和炎症反应的调节。本项目采用模拟气道三维细胞培养模型，激光共聚焦活细胞动态追踪及三维重构研究肺泡巨噬细胞吞噬过程；确定整合素-膜连蛋白-MerTK-Src-FAK-Rac1信号通路募集p130cas-CrkII-Dock180在肺泡巨噬细胞吞噬过程中的作用；利用整合素亚单位β3缺失鼠在体验证上述信号通路的作用和机制。期望深入探讨气道炎症性疾病的发病机制为寻找可能的药物靶点提供新思路。

巨噬细胞在哮喘发病中起着重要作用，其主要通过吞噬病原体和协调炎症反应来调控天然免疫应答，参与哮喘的发病。本项目以巨噬细胞系及TLR2基因缺失小鼠为研究对象，以三维细胞培养模型为主要方法，以信号通路关键蛋白干预为主要手段。首先，在国内首次采用模拟气道的三维细胞培养模型，结合激光共聚焦活细胞四维追踪成像解析巨噬细胞吞噬病原菌的动力学过程；活细胞动态观察靶向干预JNK信号后，巨噬细胞识别内化病原菌的过程及炎症反应的改变；其次，靶向干预整合素信号通路，研究整合素αvβ3调控巨噬细胞吞噬的分子机制以及其下游信号分子MerTK对炎症反应的负调控；最后，采用TLR2基因缺失小鼠，给予信号通路关键蛋白的抑制剂/协同剂，观察气道组织信号通路蛋白、基因表达，支气管肺泡灌洗液中的炎症因子水平，气道炎症相关病理特征等的变化。我们的研究发现如下：1. 我们在国内首次成功建立了模拟气道的三维细胞培养模型，并利用此模型进行激光共聚焦活细胞动态成像，此方法的建立实现了对肺泡巨噬细胞吞噬过程的四维跟踪成像，揭示了巨噬细胞空间和时间模式上的运动轨迹及其空间活动；2. 利用模拟气道的三维细胞培养模型，发现JNK信号在TLR2介导巨噬细胞吞噬病原菌过程中作用，靶向干预JNK信号通路后，TLR2蛋白表达下降，但并没有降低巨噬细胞的识别粘附能力，而是通过下调PI3K和Rac1的表达降低了巨噬细胞内吞金葡菌的能力；3. 发现整合素配体VN作用于巨噬细胞后可以进一步上调病原菌诱导的JNK、ERK、Akt等蛋白磷酸化水平，给予JNK和ERK抑制剂，发现VN与抑制剂同时作用可以下调ERK和JNK蛋白磷酸化，但对巨噬细胞吞噬病原菌没有影响；4. 发现LTA 刺激的巨噬细胞中P-MerTK蛋白表达水平明显增加，特异性抗体预处理能明显降低LTA诱导的P-MerTK、P-AKT及SOCS3蛋白表达水平，而NF-κB p65蛋白磷酸化水平，以及炎症因子TNF-a 和IL-6表达水平明显升高，提示MerTK受体在TLR2诱导的巨噬细胞炎症反应中起到反馈抑制作用；5. 利用TLR2基因缺失鼠诱导哮喘模型，通过靶向干预JNK或p-AKT信号通路，发现TLR2基因缺失显著降低气道炎症，而JNK或p-AKT抑制剂不再进一步降低TLR2基因缺失的效应。本项目为哮喘的非可控性炎症发病提供了一定的理论基础，为哮喘的治疗提供了潜在的新靶点。