家蚕微孢子虫Serpin6抑制宿主血液黑化的分子机制研究

Nosema bombycis (N. bombycis, Nb) is the pathogen of silkworm Pébrine. Infection by Nb inhibits silkworm hemolymph melanization. However, the molecular mechanism of Nb-induced host melanization inhibition has not been elucidated. It is known that insect hemolymph melanization relies on serine protease mediated prophenoloxidase cascade activation, thus tightly regulated by serine protease inhibitor proteins (serpin). Previous study indicated that Nb also has serpins (NbSPNs), and serpin 6 (NbSPN6) was detected in the hemolymph of infected silkworm. What’s more, in vitro experiment showed that NbSPN6 can inhibit prophenoloxidase cascade activation. Based on these facts, we hypothesize that Nb utilizes NbSPN6 to inhibit host hemolymph melanization, escape from innate immunity thus facilitate propagation within host. In this study, we will apply various methods, such as immunofluorescence assay, enzyme activity analysis and RNA interference, to identify the targeted protease of NbSPN6 and reveal the molecular mechanism of NbSPN6 inhibiting host hemolymph melanization. Our novel study on how pathogenic serpin regulate host immunity is not only important for silkworm pathology, but also helps to provide new strategy and resistance material for microsporidiosis prevention.

家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原，其侵染可导致家蚕血液黑化受到显著抑制，但微孢子虫抑制家蚕血液黑化的分子机制尚未阐明。研究发现，昆虫血液黑化依赖酚氧化酶原激活级联反应，且受丝氨酸蛋白酶抑制蛋白serpin调控。我们在家蚕微孢子虫中也发现一簇serpins（NbSPNs），其中serpin 6（NbSPN6）存在于微孢子虫感染的家蚕血液中且体外实验证实NbSPN6能抑制家蚕酚氧化酶原激活级联反应。因此，我们推测家蚕微孢子虫可通过NbSPN6抑制宿主血液黑化从而逃避宿主先天性免疫，成功实现其在宿主体内的扩散。本项目拟采用免疫荧光、蛋白酶活性检测、RNA干扰等技术手段，鉴定NbSPN6抑制血液黑化的靶蛋白、阐明其抑制宿主血液黑化的分子机制。研究病原serpin对宿主免疫系统的调控在蚕病学领域具有重要的创新意义，并可为研发家蚕微粒子病抗性素材提供新策略。

微孢子虫是一大类专性细胞内寄生的单细胞真核生物，具有广泛的宿主范围，可感染包括家蚕和人类在内的几乎所有种类的动物。家蚕微孢子虫感染家蚕造成家蚕微粒子病，给蚕丝业造成巨大经济损失。前期研究发现，家蚕抵御病原的重要免疫反应-血液黑化在家蚕微孢子虫感染后受到显著抑制，但其分子机制尚未阐明。已知家蚕血液黑化是由血细胞中酚氧化酶原激活级联反应激活酚氧化酶PO继而产生黑色素的过程，有众多丝氨酸蛋白酶参与。项目组前期在受感染的家蚕血液中检测到家蚕微孢子虫分泌丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin 6（NbSPN6）蛋白，推测其与宿主血液黑化抑制有关。本研究通过Western blot及免疫荧光技术等方法证实NbSPN6定位到受感染家蚕血细胞的细胞质中。表达纯化重组NbSPN6蛋白后，检测其对正常家蚕血液的黑化抑制和对PO酶活性的抑制作用，证实NbSPN6是抑制家蚕血液黑化反应的关键蛋白。对NbSPN6反应活性中心区域进行分析、并利用免疫荧光技术和酵母双杂交技术等方法证实，NbSPN6作用的靶蛋白是酚氧化酶原激活酶PPAE和血淋巴蛋白HP14。进一步利用RNA干扰技术抑制NbSPN6在受感染家蚕体内表达，并通过qRT-PCR法和PO酶活性测定等方法证实当NbSPN6表达受抑制后，宿主因家蚕微孢子虫感染而下调的PO酶活性显著回复，并且家蚕微孢子虫在宿主体内的增殖明显下降。综上，本研究首次阐明了家蚕微孢子虫通过NbSPN6抑制宿主血液黑化的分子机制，也为设计靶向NbSPN6的防控微孢子虫新策略提供了有力依据。本项目已发表论文4篇，参加国际和国内学术会议4次，培养研究生11人，已毕业3人；部分研究成果还在整理投稿中。项目组拟继续对家蚕微孢子虫如何通过多种NbSPNs相互协调、如何与宿主血液免疫相关蛋白如Hemocytin等形成互作网络进而系统性调控宿主免疫反应进行深入研究，彻底阐明家蚕微孢子虫调控宿主免疫反应的分子机理，期待能够继续得到国家自然科学基金的支持。..