Rho GTPases调节周期性张应力诱导牙周膜细胞凋亡的信号机制研究

Under stress, the study of the mechanism of apoptosis of periodontal ligament cells is always a difficult problem for everyone. Our previous studies showed that cyclic strain can induce apoptosis through Rho GDIα /caspase-3/ PARP signaling pathway, then whether other Rho GTPases involved, through which different signaling pathways remained to be further studied. This project using Flexcell strain loading system, intends to establish mechanical stimulation models of periodontal ligament cells in vitro to observe the morphological changes of apoptotic cells and apoptotic rate. Western blotting will be used to detect Rho GTPases expression(RhoA, Rac, Cdc42, etc.) and downstream possible role protein expression(MEK1/2/ERK1/2, MEK5/ERK5, Bad, Bim, caspases-3, caspases-8, etc.); RNA interference and the construction of high expression vector plasmid transfection technology will be used to investigate the signaling mechanism of Rho GTPases in regulation of apoptosis of periodontal ligament cells induced by cyclic strain with the characteristic and innovation of interdisciplinary.

在张应力作用下，牙周膜细胞的凋亡机制研究一直是困扰大家的一个难题。我们前期已研究表明周期性张应力可以激活Rho GDIα /caspase-3/ PARP信号通路引起细胞凋亡，那么其他的Rho GTPases是否参与其中，是通过哪些不同的信号通路调节的有待进一步研究。本项目拟采用 Flexcell 细胞应力加载系统建立人牙周膜细胞体外培养－力学刺激模型，观察细胞凋亡形态和凋亡率；应用 Western blotting 检测Rho GTPases ( RhoA, Rac, Cdc42等)及下游可能的作用蛋白(MEK1/2/ERK1/2, MEK5/ERK5, Bad, Bim, caspases-3, caspases-8等)的表达；应用RNA干扰和构建高表达载体质粒转染技术，探讨Rho GTPases调节周期性张应力诱导牙周膜细胞凋亡的信号机制，具有学科交叉的特色与创新。

目的：探讨Rho-GTPase激活蛋白在病理性周期性应变诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡中的作用。 .方法：采用FX-5000T系统将牙周膜成纤维细胞暴露于20%张应力作用下6h或24h后，通过real-time PCR和western blotting检测Rho-GTPase激活蛋白ARHGAP10、ARHGAP17、ARHGAP21、ARHGAP24和ARHGAP28的表达水平。然后，将细胞置于20%张应力作用培养24小时，分别用流式细胞仪、western blotting和Rac1/Cdc42活化试验检测细胞凋亡率、裂解Caspase3蛋白水平和Rac1/Cdc42活性。最后，将Rac1抑制剂（NSC23766）预处理后的细胞导入siARHGAP17，流式细胞仪检测细胞凋亡率。 .结果：ARHGAP17是20%周期性应变作用下牙周膜成纤维细胞中表达量下降最快的基因。流式细胞术分析显示，20%的张应力作用使细胞凋亡率和Caspase3水平升高，而ARHGAP17的过度表达则使牵张诱导的细胞凋亡和Caspase3的表达减少。此外，Rac1/Cdc42激活实验发现20%的张应力增强了Rac1/Cdc42的活性，而ARHGAP17的过表达减弱了Rac1/Cdc42的拉伸诱导的激活。进一步分析表明，ARHGAP17基因敲除可提高细胞凋亡率，NSC23766可降低siARHGAP17诱导的细胞凋亡。 .结论：ARHGAP17通过抑制病理性周期性应变诱导的牙周膜成纤维细胞凋亡。