sphingomonas sp. SJ-1对三苯甲烷类染料降解脱色的机制研究

三苯甲烷类染料对水源和水产品的安全问题已引起了广泛重视并急需解决，三苯甲烷类染料的微生物降解已成为当前新的研究热点。细菌的三苯甲烷类染料脱色机制，仅在三苯甲烷还原酶及其基因的研究方面取得了突破性进展，而其它相关降解脱色酶还未得到分离纯化，相关降解基因也未得到克隆。本项目拟对分离筛选到的高效降解细菌Sphingomonas sp. SJ-1致使三苯甲烷结构裂解的酶进行分离纯化，揭示裂解酶的分子量、形态和等电点，研究底酶的底物特异性和影响催化活性的因素等酶学特性；拟采用鸟枪法构建文库克隆参与三苯甲烷结构裂解的酶基因，并实现高效表达，以从蛋白和基因水平继续阐明细菌对三苯甲烷类染料的降解脱色机理，也为三苯甲烷类染料污染环境的生物修复提供技术支持。

本研究项目的结果包括两方面内容：（1）三苯甲烷裂解酶的分离纯化；（2）三苯甲烷裂解酶基因的克隆及表达。第一方面，通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-75 凝胶层析和PAGE 切胶回收电洗脱等手段，对Sphingomonas sp. SJ-1致使三苯甲烷结构裂解的酶进行了分离纯化，裂解酶是单体酶，分子量约55KDa，等电点4.5。第二方面，以鸟枪法构建了Sphingomonas sp. SJ-1的总DNA文库，筛选到3个阳性克隆子。用软件分析及亚克隆的方法，确定了编码三苯甲烷裂解酶（TlyA）的1527bp长结构基因tly。将该结构基因连接到表达载体pET29a上，在E. coli BL21中实现了高效表达。