基于分子自组装策略的麦胚蛋白-金属离子络合机制研究

Metal ion-induced protein self-assembly is a fast, mild methods to prepare self-assembly system .The principle advantage is the metal ions trigger the body, with a metal ion bonded to the functional group of the protein ligand for the assembly. The system could overcome the drawback of traditional non-covalent self-assembly--low efficiency, poor stability limitations greatly promote bioavailability. Based on the polarity differences of amino acid structure and functional groups, the peptide chain was result in self-assembly and metal ion coordination, rich in resources and underutilized grain processing by-products of wheat germ, using two the price of the metal cation complexing modified wheat germ protein(WPG) self-assembly carrier for its self-assembly and complexation modified before and after the conformation change and promote the absorption mechanism is not clear the status quo carried out in three areas: (1) WGP building unit, self-assembled into a specific biological carrying materials, dynamic tracking the self-assembly process, we explore the self-assembly mechanism; (2) self-assembly of protein nanospheres prepared with the metal ions in aqueous solution of wheat germ protein - metal ion complexation material, the use of molecular dynamics simulation to calculate the binding sites of complexes, suggesting that the key ligand residues of its contribution to the stability of; (3) absorption through the establishment of the small intestine in vitro Caco-2 cell model and the isotope tracer technique complexes intake, the transmembrane mode of transport and metabolic pathways, to investigate the intake, absorption and transportation kinetic mechanism; above study crops rich source of protein and promote metal absorption methodology and basic theory.

金属离子诱导蛋白质自组装是一种快速、温和的自组装体制备方法。其原理与优势在于以金属离子为触发体，与带有键合金属离子官能团的蛋白质进行配位组装，突破了传统非共价键自组装体系形成效率低、稳定性差的局限，极大促进了金属离子的生物利用率。针对金属离子诱导蛋白质自组装机理及其在生物体内代谢机制尚不明晰的现状，项目以具有良好生物相容性的麦胚蛋白为构筑单元，采用二价金属离子诱导麦胚蛋白自组装形成络合物，开展三方面研究：（1）探究金属离子与蛋白分子络合物中的电子转移、能量传递和结构变化规律，阐明金属离子诱导蛋白质自组装机理；（2）采用分子动力学模拟方法计算配合物的结合位点，推测关键配位残基对其稳定性的贡献；（3）通过建立小肠体外Caco-2细胞吸收模型和同位素示踪技术研究配合物摄入、跨膜运输方式及代谢途径，探讨其摄入、吸收转运动力学机制；以上研究将丰富低值植物蛋白质及其促金属吸收领域的方法学和基础理论。

麦胚作为营养丰富、价格低廉、储量丰富的植物蛋白资源，未获得有效的利用，造成资源浪费。麦胚蛋白是一种完全蛋白，生物效价高，氨基酸比值合理，富含谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸等，氨基酸肽段具有独特的疏水、亲水间隔排列和长支链亲水侧链，是研究蛋白自组装及金属离子络合修饰的极佳载体。本项目主要通过两种方式诱导麦胚蛋白发生自组装行为，以提高麦胚蛋白的附加值。一种是蛋白质通过定量酶解和添加钙离子诱导自组装行为，另一种是通过电子束诱导。麦胚蛋白酶解后产生的多肽在添加钙离子的条件下，通过调控温度、pH、多肽与钙的物质的量之比、反应时间得到最优组装条件为：麦胚多肽与钙离子物质的量之比为3:1，pH 9.5，体系温度65 ℃，反应时间60 min，该条件下，螯合率为86.21%。另外，麦胚蛋白酶解物经过超滤、阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱分离纯化得到高亲和钙活性的多肽。该多肽经LC-ESI/MS鉴定，其氨基酸序列为Phe-Val-Asp-Val-Thr（579 Da），钙的螯合率为89.94%。通过紫外光谱、红外光谱、X衍射、圆二色谱和核磁共振等结构表征，发现螯合物多肽链中的羧基氧和氨基氮参与螯合反应，Asp、Thr和Val是钙的螯合位点。并根据以上结果，推断出3种可能的多肽与钙螯合模型。体外模拟胃消化实验表明，Phe-Val-Asp-Val-Thr-钙螯合物相较于碳酸钙和葡萄糖酸钙具有缓释作用。体外模拟肠道消化实验表明，Phe-Val-Asp-Val-Thr-钙螯合物能提高钙的可溶性。除此之外，我们还通过研究电子束引起麦胚蛋白结构和功能性质的改变，建立辐照剂量、蛋白结构和蛋白功能性质之间的联系。因此，本课题的研究，对于提高麦胚蛋白加工利用水平，掌握基于分子自组装的植物蛋白自组装体系的关键制备技术及相关机理，丰富金属元素胃肠道吸收基础理论，都具有非常重要的现实意义和学术价值。