基于氧化应激介导的铁死亡探讨Nrf-2对终末期肾病血管钙化的作用机制

Vascular calcification (VC) plays a lethal role for the patients at the end-stage renal disease (ESRD), though few has been known about the exact mechanism. Oxidative stress (OS) is considered to be the most important causes of ESRD for its induction of ferroptosis. Previous studies indicated that Nrf2, the transcription factor erythroid 22p45-related factor -2 and its downstream target gene ARE, are capable in scavenge of ROS, anti-ferroptosis, and increasing the tolerance of hepatoma cells to medicine. Our previous study found that smooth muscle cells (VSMCs) experienced VC, are occupied with OS and ferroptosis at ESRD. Meanwhile, we also found that activation of Nrf2 alleviated the mitochondria OS and VC. Taken toghether, we assumed that, Nrf-2-ARE might be potent in inhibiting the ferroptosis to relieve the VC in ESRD, with its powerful anti-oxidation ability. Therefore, we designed the present project, with the aims: 1) to reveal the interaction between ferroptosis and VC in ESRD; 2) to confirm that whether Nfr2 mitigate the VC through anti-oxidative stress which might provide new target for prevent and treatment of VC at ESRD.

血管钙化是终末期肾病(ESRD)患者致死的主要诱因，但其机制复杂。氧化应激可促血管平滑肌细胞成骨样变，是ESRD血管钙化的重要机制，其能介导细胞铁死亡发生。既往研究发现转录因子红细胞系22p45相关因子-2(Nrf-2)可清除活性氧(ROS)，而抗氧化应激，抑制铁死亡，促肝癌细胞耐药。我们发现ESRD血管钙化发生时血管平滑肌细胞中氧化应激效应增强，并伴随着细胞铁死亡的发生；激动Nrf-2可抑制线粒体氧化应激，改善ESRD大鼠血管钙化。因此提出“铁死亡促血管平滑肌细胞成骨样变，诱发ESRD血管钙化；Nrf-2参与清除ROS抗氧化应激，进而抑制氧化应激介导的铁死亡，最终阻止ESRD血管钙化进展”的科学假说。本项目拟首次阐释铁死亡与ESRD血管钙化的密切关系，进一步基于氧化应激介导的铁死亡来深入探讨Nrf-2对ESRD血管钙化的作用机制，为寻找防治ESRD血管钙化新靶点提供理论依据。

血管钙化是终末期肾病(ESRD)患者致死的主要诱因，但其机制复杂。氧化应激可促血管平滑肌细胞成骨样变，是ESRD血管钙化的重要机制，其能介导细胞铁死亡发生。本项目在临床研究中观测铁死亡与ESRD血管钙化有密切关系。构建大鼠血管平滑肌细胞（RASMCs）钙化模型并施以铁死亡干预，进一步利用蛋白质组学分析寻找铁死亡调控血管钙化的新靶点与新机制。利用血管平滑肌特异性敲除Nrf2的Nrf2flox/flox-Tag cre基因工程小鼠成功构建5/6肾切除血管钙化模型，进一步基于铁死亡探讨Nrf-2对ESRD血管钙化的作用。对正常RASMCs和钙化RASMCs进行蛋白质组学实验，筛选出113个对血管钙化具有潜在调控作用的蛋白分子，其中可筛选到铁死亡和自噬相关蛋白。在RASMCs细胞钙化模型中发现在高磷诱导的钙化的RASMCs中，Liperfluo和LPO检测显示脂质过氧化物水平升高，而铁死亡抑制剂减少细胞内脂质过氧化物的水平；Mitotracker 显示了RASMCs发生钙化时，线粒体形态发生改变，而铁死亡抑制剂能减轻线粒体的损伤；电镜显示高磷诱导的RASMCs中线粒体出现铁死亡的典型特征；表明血管钙化时RASMCs氧化应激效应增强伴随铁死亡的发生。电镜观察到ESRD血管钙化的患者血管平滑肌细胞的确有发生铁死亡，荧光多光谱结果显示慢性肾脏病血管钙化的人和大鼠动脉组织中均可见血管平滑肌细胞成骨样转分化伴铁死亡现象。多光谱荧光成像发现在CKD患者的钙化血管中GPX4和SMA22α的表达降低，NCOA4、SMARCA4和RUNX2的表达增多;WB结果显示在钙化的RASMCs细胞模型中干预铁死亡以后RANKL的表达均发生显著变化，提示铁死亡可调控血管平滑肌细胞成骨样转分化。利用Nrf2flox/flox-Tag cre小鼠构建5/6肾切除血管钙化模型，发现血管平滑肌特异性敲除Nrf2以后小鼠的胸主动脉和腹主动脉组织中钙化均显著加重，电镜观测出现显著的铁死亡且在钙化小鼠血管中膜组织中铁死亡相关蛋白表达显著降低。本项目按计划研究阐释铁死亡促血管平滑肌细胞成骨样变，诱发ESRD血管钙化；Nrf-2可抑制氧化应激介导的铁死亡，最终阻止ESRD血管钙化进展, 为寻找防治ESRD血管钙化新靶点提供理论依据。