鱼腥蓝细菌PCC 7120中ppGpp介导的严谨反应的确定及其调控异形胞发育起始的机制研究

ppGpp是介导严谨反应发生的信号分子。在鱼腥蓝细菌PCC 7120中是否存在严谨反应目前没有确定的结论。本课题前期研究发现，鱼腥蓝细菌PCC 7120基因组中存在一个具有合成和水解ppGpp功能的relA/spoT的同源基因all1549，在氮源缺乏的条件下，all1549突变体不能分化形成异形胞来执行生物固氮的功能，但其调控机制并不清楚。本课题将确定在氮源缺乏的条件下，鱼腥蓝细菌PCC 7120中有ppGpp的积累，确定all1549具有合成和水解ppGpp的功能，并确定其活性位点，确证严谨反应在鱼腥蓝细菌PCC 7120中的存在。同时研究ppGpp调控异形胞发育起始的机制，确定ppGpp在异形胞发育调控网络中的地位。本研究的开展将进一步拓宽ppGpp的生理功能，揭示其在蓝细菌中的代谢机理，同时进一步完善异形胞发育的调控网络，为蓝细菌的研究和利用提供新的方向。

在缺乏氮源的条件下，丝状蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120会分化形成异形胞专一执行生物固氮的功能。异形胞的分化是一个缓慢而复杂的过程，大约需要24小时，涉及广泛的形态和生理变化。鸟苷四磷酸（ppGpp）是严谨反应的信号分子，可以调节细胞的生理活动，以保证细菌在营养缺乏等不良环境中的生存。异形胞发育早期蓝细菌胞内也会有ppGpp积累的过程。本研究结果显示，Anabaena中relA/spoT的同源基因relana（即all1549）具有合成ppGpp的功能。化合态氮源缺乏后，relana的表达上调约2倍左右，并且主要集中在营养细胞中表达。在relana中断失活突变体MHRS中，ppGpp的合成受到严重的影响。而且，化合态氮源缺乏后，MHRS突变体既不能发育异形胞也不能维持生长。在突变体MHRS中表达野生型relana基因能够互补突变体的表型。hetR基因在突变体中不能正常地上调表达，而且异位超表达hetR基因亦不能够回复突变体的表型。突变体在缺乏化合态氮源3-6 h后迅速地失去生存能力，但是如果在6 h之前补加化合态氮源到培养基中，突变体可以回复正常生长。因此，我们认为当培养基中缺乏化合态氮源后，ppGpp在重新平衡细胞内代谢活动的过程中起到了很重要的作用，而且ppGpp的这种调控作用不仅是菌丝体生存所必需的，同时也是异形胞能正常发育的保障。. alr1550是一个与relana相邻的未知功能基因。本研究结果显示，alr1550响应缺氮信号，在异形胞分化早期上调表达，且主要集中于前异形胞和成熟异形胞中表达。alr1550启动子区存在保守的NtcA结合位点。NtcA可以与alr1550启动子片段特异结合，而alr1550在ntcA突变体中不能正常表达，这些结果表明alr1550的表达受NtcA的直接调控。alr1550突变体中异形胞分化分化频率显著高于野生型。实时定量荧光PCR的检测结果显示alr1550失活突变体中hetR的上调表达程度高于野生型，而负调控因子hetN的转录水平则显著低于野生型。同时，超表达alr1550会引起细胞分裂异常。这些结果表明，alr1550不仅参与异形胞分化的调控，同时也参与细胞分裂的过程，但alr1550的作用机制有待进一步研究。