人食管癌中Src激酶对有丝分裂阻滞缺陷蛋白2的调控作用及其机制研究

Src家族激酶突变或活化与肿瘤的发生、发展和耐药密切相关，有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（MAD2）是有丝分裂期纺锤体检测点重要元件，其缺陷引起染色体不稳定性并导致细胞畸变和耐药。我们前期发现，在人食管癌中，Src激酶异常活化的组织MAD2表达普遍缺陷，细胞内纺锤体和中心粒异常，利用SRC/ABL激酶抑制剂Dasatinib抑制高表达Src的人食道癌细胞系KYSE180的Src激酶后，观察到可以逆转细胞MAD2缺陷，引起细胞G1期阻滞发生凋亡并对化疗敏感，但具体调控机制尚不明确，本课题，我们拟用比较基因组杂交技术检测Src基因突变的人食管癌细胞内染色体不稳定性；基因转染和siRNA技术建立Src高表达、低表达细胞模型，Dasatinib单药/与细胞损伤剂联合作用各细胞模型，观察处理前后细胞有丝分裂形态学变化和Src、MAD2水平及二者的空间关系变化，进一步揭示Src对MAD2的调控作用和机制。

Src家族激酶突变或活化与肿瘤的发生、发展和耐药密切相关，有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（MAD2）是有丝分裂期纺锤体检测点重要元件，其缺陷导致染色体不稳定性、细胞畸变和耐药。本课题，我们利用组织芯片发现，在相同人食管癌组织连续切片中，Src激酶异常活化，而MAD2表达普遍缺陷，利用蛋白质印迹法检测食管鳞癌细胞株KYSE180、EC109、KYSE30和人永生化食管上皮细胞株SHEE中总Src和磷酸化Src激酶的表达，发现磷酸化 Src在肿瘤细胞中高表达，而在永生化细胞中低表达。用不同剂量的Src酪氨酸激酶抑制剂dasatinib加化疗药物多西紫杉醇作用表达不同水平磷酸化Src激酶的食管鳞癌细胞株后，分别采用MTT法、FCM法、蛋白质印迹法和裸鼠皮下移植瘤实验观察处理前后Src激酶及MAD2水平变化以及抑制Src激酶对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和裸鼠皮下移植瘤的影响，研究发现KYSE180、EC109和KYSE30细胞中Src激酶显著活化，而在SHEE细胞中未见活化Src激酶。磷酸化Src被抑制后可显著抑制食管癌细胞增殖，阻碍细胞G1/S期转换，促进细胞凋亡，上调caspase3、cytochrome C和Bax等凋亡相关蛋白的表达，并上调MAD2的表达水平。另外，抑制Src激酶可显著抑制裸鼠皮下KYSE180细胞移植瘤的生长，这些体外体内实验揭示Src激酶可通过直接及间接调控MAD2，从而影响食管癌细胞的增殖和对化疗药物的敏感性，dasatinib也渴望成为治疗不适合手术的晚期食管癌患者新的分子靶向药物。