Rho GTPases信号参与微纳米形貌调控成骨细胞行为的机制研究

Micro/nano-textured topography is important for bone formation, but the underline mechanisms is still not very clear. Our previous study found that the osteoblasts morphology obviously changed on different micro/nano-textured titanium surface. Rho GTPases family is a key regulator of cell morphology. This research proposes that Rac1, Cdc42 and RhoA, which are the main members of Rho GTPases family, play an important role in mediating cytoskeleton and further affect cell behavior. Our previous study also found that beta-catenin and MAPK signaling pathways were critical in regulating osteoblasts behavior. According to the previous results, the present research proposes that Cdc42 prevents the beta-catenin cytoplasm degradation and then activates the Wnt/beta-catenin pathway. Rac1, Cdc42 and RhoA can activate MAPK pathways respectively and lead into the enhancement of osteoblasts functions. The cytology, molecular biology and animal experiment method will be used to comprehensively confirm the hypothesis.

研究发现骨植入材料表面微纳米形貌影响骨组织形成，但微纳米形貌调控细胞行为的分子机制尚缺乏全面深入研究。我们前期研究发现成骨细胞在不同微纳米形貌表面形态差异明显，而Rho GTPases家族在调控细胞形态中起到关键作用。本课题提出Rho GTPases家族成员Rac1、Cdc42和RhoA在调控细胞骨架进而影响细胞行为中起重要作用；并且根据我们前期研究中发现微纳米形貌通过beta-catenin和MAPK这些关键信号通路调控成骨细胞行为的现象，进一步提出Rho GTPases一方面通过Cdc42阻止beta-catenin胞浆内的降解进而激活该信号，另一方面通过Rac1、Cdc42和RhoA分别激活MAPK信号，促进成骨细胞功能。本课题在前期研究基础上，采用细胞学、分子生物学和动物实验方法全面深入研究证实该假设，从而探明骨植入材料表面微纳米形貌与细胞相互过程中的关键信号分子及其下游信号通路。

本研究创新性地通过酸蚀配合阳极氧化方法制备类似于骨结构的微纳米复合梯度形貌，并结合SEM、AFM及接触角测量仪进行表面结构与性状分析。观察微纳米形貌表面细胞黏附计数、活力测定、形态及骨架观察、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等对rBMSCs形态与成骨分化功能的影响，通过对比Cdc42siRNA 及Rac1siRNA转染前后rBMSCs形态与成骨分化功能评价微纳米形貌表面Rho GTPases成员Cdc42、 Rac1介导对rBMSCs的调控作用。采用实时定量PCR及Western blot方法检测Cdc42对Wnt/-catenin信号通路及及Rac1对MAPK信号通路的影响，从而探索微纳米形貌表面可能存在的调控rBMSCs形态与功能变化的分子机制。转染后微纳米形貌表面rBMSCs细胞黏附计数、碱性磷酸酶分泌、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨基因表达等均明显下降，微纳米形貌表面细胞处于相对萎缩状态，丝状伪足和板状伪足明显减少，在共聚焦显微镜下胞浆内红色纤维网状结构染色明显减弱。Cdc42siRNA转染大大降低了微纳米形貌表面β-catenin mRNA表达（P<0.05）。同时Cdc42基因沉默明显抑制了R5及R20组表面Nucleus β-catenin及p-GSK3β蛋白表达。R5及R20组明显增加了Wnt经典配体Wnt3a 、Wnt1及整合素Integrinβ1、Integrinβ3和Integrinβ6的mRNA表达。微纳米形貌表面显著上调了Rac1、p-ERK1/2、p-p38表达水平,而未检测到JNK相关蛋白的表达。Rac1siRNA转染后微纳米形貌表面rBMSCs片状伪足数量和长度均减少、胞浆内红色纤维网状结构显著减少、特异性抗体Rac1的免疫荧光强度明显减弱。相比于野生型，Rac1siRNA显著抑制R5及R20组表面碱性磷酸酶合成、细胞胶原分泌、细胞外基质矿化及成骨相关基因的表达。Western blot结果显示Cdc42基因沉默明显抑制了R5及R20组表面p-p38和p-ERK1/2的蛋白表达，而试样表面t-p38和t-ERK1/2的表达水平无明显改变。综上所述，Cdc42/Wnt/-catenin与Rac1/MAPK信号通路均参与调控微纳米形貌rBMSCs形态及成骨分化功能。其机制主要为：微纳米形貌通过激活 Rho