Rho信号通路在张应变诱导人牙周膜细胞细胞骨架重建中的作用机制

在应力作用下人牙周膜细胞（hPDLCs）增殖和迁移在正畸牙周组织重建中起重要作用。研究在应力作用下hPDLCs的生物学特性，将有助于阐明人正畸牙周组织重建的力学生物学机制，对口腔正畸治疗机理研究有理论和临床意义。本项目拟采用Flexcelll细胞应变加载体外培养hPDLCs，观察张应变作用下hPDLCs增殖和迁移的变化；以免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术，对不同张应变条件下细胞骨架结构和聚合状态进行基于图像灰度共生矩阵的纹理描述分析；应用Western blot检测hPDLCs细胞骨架成分和Rho家族相关信号分子表达；应用RNA干扰和构建高表达载体质粒转染术，检测hPDLCs细胞骨架重建及Rho家族相关信号分子在张应变调控hPDLC迁移和增殖中的影响，明确张应变－Rho通路－细胞骨架－细胞迁移、增殖之间的关系，阐明Rho信号通路在张应变诱导hPDLCs细胞骨架重建中的作用及其分子机制。

一.周期性张应变促进人牙周膜细胞骨架重排，Rho信号通路参与了此过程。体外应用FX-5000T细胞应变加载系统，对人牙周膜细胞（hPDLCs）施加一定幅度频率时间的周期性张应变。以未加载的细胞作为对照组。观察细胞形态变化，细胞骨架蛋白F-actin的变化，检测Rho通路相关蛋白的表达变化。结果与静态组相比，周期性张应变诱导hPDLCs细胞骨架重排差异有统计学意义，Rho信号通路Rock和p-cofilin蛋白表达增加(P＜0.05)。.二.大鼠实验性牙齿移动。24只雄性SD大鼠随机分为四组。麻醉状态下，用闭合线圈弹簧对右上第一磨牙施加40g力。未经处理的对侧作为对照。结果显示，与对照组相比 ，ROCK、LIMK和cofilin表达在张力侧（远冠区）显著增加。表明Rho参与正畸过程中牙周组织的改建，且可以调节ROCK，LIMK，cofilin的活性。.三.病理周期性张应变通caspase-3/PARP途径诱导人牙周膜细胞凋亡。hPDLCs加载20%幅度一定频率时间的周期性张应变，检测细胞凋亡，凋亡蛋白的表达。结果：hPDLCs受到病理性周期性张应变时存在凋亡，并以一种时间依赖的方式增加，裂解的caspase-3和PARP蛋白随着时间增加。抑制caspase-3的活性却可以抑制细胞的凋亡，但并不能抑制由其他通路导致的凋亡。.四.Rho-mDia1信号通路参与周期性张应变诱导的细胞骨架重排。hPDLCs受载周期性张应变，以未加载的hPDLCs作为对照组。结果显示RhoA-GTP，profilin-1蛋白，RhoA与mDia1结合增加，而与静态组相比Rho-GDIa表达水平减少，细胞骨架重排增强。Rho-GDIa高表达或mDia1-siRNA转染均可以导致profilin-1表达和细胞骨架的重组减少，但Rho-GDIasiRNA转染有相反效果。.五.TGF-β1诱导人牙周膜细胞细胞骨架重排。细胞中加入10ng/ml的TGF-β1，观察其形态学变化、F-肌动蛋白重排。结果发现TGF-β1诱导hPDLCs细胞骨架重排，激活ROCK蛋白的表达，并增加p-lIMK和p-cofilin的蛋白表达。ROCK抑制剂Y-27632使ROCK，p-lIMK和p-cofilin的蛋白表达下降。表明TGF-β1通过上凋ROCK，p-lIMK和p-cofilin的活性诱导hPDLCs细胞骨架重排。