细菌组氨酸激酶信号感应区快速进化与功能分化的实验生物学分析

组氨酸激酶是细菌双组分信号转导系统的组分之一，其氨基端的信号接受区感应外界理化刺激，是决定信号转导特异性的重要因子。前期研究发现黄单胞菌中调控致病力的组氨酸激酶VgrS信号接受区发生了快速进化，将野油菜黄单胞菌（Xcc）VgrS的信号接受区替换为Xoo的后，嵌合基因突变体的致病力明显下降，表明该结构域发生了功能分化。本项目拟通过遗传与生化的方法阐明VgrSXoo和VgrSXcc快速进化和功能分化的分子机制。将在突变分析的基础上，利用ChIP-seq方法筛选对比VgrSXoo和VgrSXcc的调控元，验证受VgrSXoo和VgrSXcc特异性调控的关键基因。深入研究将确定对结构与功能变化发挥重要作用的序列位点。同时，对比该结构域发生变异后，VgrS在蛋白质磷酸化过程中激酶-磷酸酶-磷酸转移酶活性的差异，以及对下游信号转导途径的影响。研究结果将为理解重要信号蛋白结构与功能的关系提供新的证据。

双组分信号转导系统VgrS/VgrR是植物病原－野油菜黄单胞菌（Xcc）中一个重要的调控体系。其中，受体组氨酸激酶VgrS能够感应外界未知理化信号的刺激。前期研究发现VgrS信号接受区发生了快速进化。通过分析该结构域细菌是否能够感应外界金属离子的变化，本项目证明VgrS氨基端的信号接受区能够直接与Fe3+离子结合，感应外界Fe3+离子浓度的变化，进而影响VgrS的自磷酸化水平。因此，VgrS/VgrR是调控细菌Fe吸收和转运相关基因表达的重要调控系统。首先利用蛋白质双向凝胶电泳技术对VgrR的调控元进行了组学分析，筛选并得到一个重要的下游被调控基因TonB-dependent receptor-XC_1241。实时定量PCR和GUS活性检测证明，VgrS/VgrR是XC_1241的负调控因子。EMSA实验证明VgrR能够结合到XC_1241的启动子序列区域，表明属于特异调控；研究结果显示体内Fe2+离子通过影响VgrR与XC_1241启动子区的结合力，可能通过抑制VgrR的磷酸化水平，从而解除VgrR对XC_1241的抑制；进一步的研究表明，VgrS/VgrR的磷酸化水平取决于环境中Fe3+的离子浓度：高浓度的Fe离子能够抑制VgrS的自磷酸化活性，从而去抑制XC_1241的表达。本研究结果从分子水平阐述了外界环境刺激对双组分调控系统的酶活差异及下游信号转导途径的影响，为理解VgrS信号接受区发生的快速进化提供了坚实的证据。