离体麦胚内源蛋白酶活化途径及ACE抑制肽富集调控研究

麦胚是面粉加工的副产物，含有丰富的营养物质与功能成分，但目前国内麦胚主要用于饲料，使麦胚资源的营养价值与经济价值没有充分体现。研究麦胚的生化特性、开拓麦胚资源高效利用新途径是国家"十一五"科技攻关计划的重要内容。宁夏作为全国重要商品粮基地之一，小麦产量和加工量迅速增加，而麦胚资源的深度开发与利用几乎为零。本研究以离体麦胚为原料，采用生物孵育技术，探索麦胚中内源蛋白酶类型及活力变化规律，揭示其特性与活化条件；通过动员与调节麦胚内源蛋白酶活力，促使其降解自身蛋白产生并积累引起人体血压升高的血管紧张素转移酶（ACE）抑制肽，揭示外源激素及酶激活剂对孵育麦胚中蛋白质降解和ACE抑制肽富集的调控机理；为宁夏及国内功能性麦胚产品的系列化开发、实现让人们在日常饮食中改善健康水平的目标提供理论依据。

本研究以离体麦胚为原料，分别在4 °C、25 °C和37 °C条件下保藏，一个月后，经测定其含水量下降，大分子物质降解，小分子物质生成，脂肪严重酸败，蛋白酶活力及肽富集能力没有显著下降，说明离体麦胚短期保藏能够提高多肽富集能力。研究发现麦胚中含有天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶及金属蛋白酶四种蛋白酶，以半胱氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶为主，两者最适反应温度均为50 ºC，最适反应pH分别为5.5和7.5，当pH5.5时，麦胚蛋白酶可被Cu2+, Ca2+，Li+ 及巯基乙醇强烈激活，当pH7.5时，被Mg2+, Mn2+, Ba2+ ，Zn2+强烈抑制，而半胱胺酸、谷胱甘肽对内源蛋白酶没有明显作用。麦胚蛋白酶对酪蛋白的亲和力高于牛血清蛋白、卵蛋白和明胶，且pH5.5时麦胚蛋白酶对酪蛋白的亲和力高于pH7.5时的亲和力，说明在给予适当的孵育条件下，离体麦胚中的内源蛋白酶可被有效激活，从而具备降解自身蛋白质产生具有特殊生理活性的小分子肽及氨基酸的能力，因此孵育时间、温度、pH及液料比等因素会影响麦胚中肽富集量和ACE抑制活性，经Box-Behnken设计实验优化得到最优孵育条件为：孵育时间7 h, 温度47 °C, pH 4.4及液料比8.14，在此条件下孵育液具有最高ACE抑制率及肽含量。此外，根据麦胚内源蛋白酶的种类及特性，通过添加酶的激活剂或抑制剂可以调控内源蛋白酶的活性，从而使ACE抑制肽得以富集。实验结果表明，在麦胚孵育时添加ZnSO4，MnSO4和CaCl2对麦胚蛋白酶活力有显著的影响，当ZnSO4, MnSO4和CaCl2的浓度分别为0.57 mmol/L、1.40 mmol/L和1.09 mmol/L时内源蛋白酶活性最高。在上述条件下孵育麦胚10 h，麦胚自身含氮物质剧烈转化，形成复杂的酶反应体系，清蛋白与球蛋白往谷蛋白转化，蛋白质亚基分子量减小，某些大分子量亚基消失，小分子量亚基生成。通过乙醇沉淀、葡聚糖凝胶G-25、G-10过滤及DEAE-Sephcrose-FF分离纯化，可得到纯度80%以上的麦胚ACE抑制肽溶液，液相色谱检测知其中有7种肽，通过液质鉴定肽结构，得到4个具有高活性的ACE抑制肽及具有ACE抑制活性的氨基酸，它们抑制作用的IC50 值分别是115.20, 94.87, 40.56, 26.82, and 5.86 μM.