蛋白激酶Plk1新型结合蛋白的鉴定及其在有丝分裂中的作用机制研究

An important hallmark of tumor cells is the uncontrolled proliferation and cell division. Inhibiting the activity of essential mitotic regulatory factors is a usual strategy to limit the malignant proliferation of cancer cells. As the key regulator of mitosis, the protein kinase, Plk1 is over-expressed in many kinds of tumors, and therefore becomes a promising target for the cancer therapeutics. Understanding how Plk1 activity is regulated in mitosis is an important research topic. In our preliminary experiments, we have identified a new Plk1-interacting protein (PIP). In this study, we aim to reveal the molecular basis for the PIP-Plk1 interaction. We will examine the spatio-temporal dynamic interaction of PIP with Plk1 in the cell cycle. We will design a series of experiments to determine the important roles of the PIP-Plk1 interaction in the regulation of timely G2/M transition and normal chromosome alignment in mitosis. We speculate that PIP interacts with protein kinases Aurora A and Plk1, which promotes the phosphorylation of Plk1 at threonine 210, thereby triggering and maintaining Plk1 activity to guarantee the normal mitotic progression. We will also examine how PIP cooperates with other known Plk1-binding proteins to regulate Plk1 in mitosis. Upon successful conclusion of this study, we will have revealed new mechanisms for the regulation of mitosis progression and chromosome segregation, which will also help the development of anti-mitotic cancer therapy.

控制细胞分裂所必需的调控因子是抑制癌细胞恶性增殖的常用策略。作为调节有丝分裂的关键蛋白激酶，Plk1在许多肿瘤组织中过量表达，因而成为抗癌的重要靶标和细胞周期研究的重要课题。我们的预实验初步鉴定了Plk1新的结合蛋白PIP。我们将深入分析Plk1结合PIP的分子基础，探究两者的结合在细胞周期中的时空动态变化规律，全面分析Plk1与PIP的相互作用在调控细胞周期的G2/M期转换、有丝分裂期染色体整列等方面的重要功能。我们推测，PIP通过分别结合蛋白激酶Aurora A和Plk1促成Plk1第210位苏氨酸的磷酸化，进而激发并维持Plk1的活性，确保有丝分裂的正常进行。我们将验证这一假设，并探讨PIP与Plk1的其他结合蛋白一起协同调控Plk1的分子机制。本项目的顺利实施，将揭示调控有丝分裂进程和染色体分离的新机制，丰富相关基础理论，并为有丝分裂蛋白激酶靶向的抗癌研究提供新的依据。

蛋白激酶Polo-like kinase 1（Plk1）是细胞周期的重要调节因子，它在细胞周期包括从有丝分裂进入至胞质分裂的过程中都发挥重要调控作用。在G2期，激酶Aurora A（AurkA）与Bora蛋白协同作用，磷酸化Plk1激酶结构域第210位苏氨酸残基从而将其激活。研究发现，Plk1在中心体被激活，但它的活性首次被发现是在细胞核内。然而，在人体间期细胞，Bora是一个胞质蛋白且在有丝分裂期间大部分被降解。因此，不依赖Bora的Plk1激活机制是否在细胞核内发生尚不清楚。总之，Plk1激活机制尚不明确。在此项研究中，我们通过磷酸化蛋白质组学质谱分析发现一个具有磷酸化S-T-P基序的蛋白WAC，一个包含WW结构与及coiled-coil区域的适配器蛋白。不同物种序列比对显示，WAC基因序列存在五个高度保守的S-T-P基序。研究发现，G2时期及有丝分裂期间WAC的五个保守的S-S/T-P基序被磷酸化且该磷酸化依赖于Cdk1激酶。体外实验证实，Cdk1激酶能直接磷酸化重组的MBP-WAC蛋白的S-S/T-P基序。Pulldown，Far-western及免疫共沉淀实验证实，Cdk1磷酸化WAC促进其与Plk1-PBD结构域的结合。用小分子干扰RNA敲减WAC会导致Plk1活性降低，有丝分裂进入延迟及染色体整列缺陷。这些缺陷可以被外源表达的野生型WAC而不是Plk1结合缺陷型的突变体回复。此外，WAC直接结合AurkA，体外实验证实，预磷酸化的MBP-WAC能够促进6xHis-AurkA磷酸化GST-Plk1第210位苏氨酸残基促进Plk1的激活。最后我们得出结论，WAC被Cdk1磷酸化后能够增强与Plk1的相互作用进而促进Plk1的激活和有丝分裂的进入。相关研究成果发表于Cell Reports、EMBO Reports、EMBO Journal、Journal of Cell Biology和Journal of Biological Chemistry，丰富了有丝分裂调控机制研究的理论基础，并为有丝分裂靶向的抗癌研究提供了新的思路与靶点。