细菌趋化性组氨酸激酶CheA活性调控机制的结构基础

Bacterial chemotaxis is a mechanism by which motile bacteria move to favorable living condition. Bacterial chemotaxis histidine kinase CheA converts the sensory information detected by transmembrane chemoreceptors to a tunable chemical signal in the cytosol. The gross architecture of the ternary complex formed by CheA, CheW and chemoreceptor has been uncovered, but the key question of how the regulation of the kinase activity of CheA is achieved in the platform of the ternary complex remains unanswered. Given the difficulties in revealing this dynamic mechanism, I propose a new experimental strategy that focuses on the two interdomain linkers in CheA’s kinase core: hunting for the linker mutants that mimic the regulation states (“kinase-on” and “kinase-off” states) of CheA and subsequently analyzing the structures of these mutants will help understand the structural basis of CheA regulation as well as receptor signaling.

细菌趋化性是游动类细菌选择适宜生长环境的机制。细菌趋化性组氨酸激酶CheA把膜蛋白化学受体探测到的环境中的感受信号转化为细菌细胞内的可控的化学信号。多年对CheA、CheW和化学受体所组成的复合物的结构研究已描绘了此复合体的大致构造，但我们仍不清楚在这一基本结构框架中CheA活性调节是如何实现的。经过分析，我提出解决此问题的新的研究思路并将研究范围缩小至CheA激酶核心结构域之间的两个连接上: 我将通过以这两个连接为对象筛选不同激酶活性的CheA突变体来模拟CheA被抑制或激活的调节状态，并通过进一步研究这些突变体的结构来揭示CheA和化学受体信号转导的结构基础。

细菌趋化性是游动细菌选择适宜生长环境的机制。细菌趋化性组氨酸激酶CheA把膜蛋白化学受体探测到的环境中的感受信号转化为细菌细胞内的可控的化学信号。多年对CheA、CheW和化学受体所组成的复合物的结构研究已描绘了此复合体的大致构造，但我们仍不清楚CheA在此复合物中是如何被调节。近期我们发现CheA的二聚结构域(P3)、催化结构域(P4)和调节结构域(P5)之间的两个结构域间连接对CheA的激酶的活性及调控起到重要作用。本项目以这两个连接为研究目标：1）设计定向进化策略分离不同激酶活性的CheA连接突变体；2）筛选出几个CheA P4-P5连接的突变体，其激酶活性的范围为野生型CheA激酶活性的30%到670%，丧失了被受体激活的能力，甚至是在缺少P5结构域的情况下，此连接突变株足以对激酶活性造成改变。这表明此连接是一个活跃的功能模块，能够对P4结构域的催化活性施加调控作用。3）筛选出了几个CheA P3-P4连接高活性突变体，其中获得的最高激酶活性为野生型CheA激酶活性的46倍。在缺少P5或同时缺失P5和P4-P5连接时，这些P3-P4连接突变体无法实现提高自磷酸活性，表明其对激酶活性的影响需要P5结构域甚至P4-P5连接的配合来实现。这些P3-P4突变体在体内无法行使正常的细菌趋化性，受体介导的激酶活性的抑制途径被干扰，表明CheA原有的处于激活和抑制状态之间的平衡被打破， CheA表现出了高基础自磷酸化活性。4）通过将高活性的P3-P4连接和高活性P4-P5连接组合，虽然没有实现更高的激酶活性，但呈现出不同的CheA活性，甚至是低于野生型的抑制状态，表明两个域间连接对激酶活性的影响不是叠加性的，但相互影响、共同影响激酶的催化结构域活性。5）对多结构域蛋白质的研究显示多结构域蛋白在功能方面的优势。由此课题的启发，我们运用蛋白质工程技术成功改进了一个具有应用价值的能将脂肪酸转化为烯烃的酶的活性和底物范围。