基于GPCR垂钓技术研究瓜蒌薤白药对抑制血小板聚集药效物质基础

We plan to study anti-platelet effective substance of Gualou-Xiebai, which used as drug pair in Traditional Chinese Medicine, using the research method of chemical medicine for reference. The antagonists would be fished from the extracts of Gualou and Xiebai by binding with two critical anti-platelet receptor proteins, P2Y12 and PAR1. Furthermore the ligands would be isolated and identified by MS-RHPLC, LC-MS analyses and spectra techniques. Also, we would study the compatible effect on the quantitative of these effective composition or new constituents produced by the combination of the couplet medicines too. This project integrate the application of TCM chemistry techniques, in vitro anti-platelet assay, receptor-ligand binding research and LC-MS means to establish a new method, which is especially useful to find the anti-platelet effective substance of TCM in high-speed and narrow-target. Besides, the research result will provide fundamental data to clarify the TCM quality and pharmacological mechanism of the traditional drug pairs Gualou-Xiebai.

为研究经典药对瓜蒌-薤白抑制血小板聚集的药效物质基础，本课题借鉴抗凝血化学药物筛选过程中蛋白与化合物结合的研究方式，选取介导血小板活化和聚集的重要GPCR 受体- P2Y12 和PAR1 蛋白，从瓜蒌-薤白药对提取物抗血小板聚集活性组分中垂钓P2Y12和PAR1 受体拮抗剂，结合LC-MS 手段，靶向分离、鉴定这些活性物质，并同时研究两药配伍对有效成分溶出的影响以及鉴定配伍共煎煮产生的新的活性成分。本课题综合运用中药化学成分导向分离、体外血小板聚集测试、蛋白-配体结合及LC-MS 技术，探索一种基于"靶蛋白结合-LC/MS 分析-MS 导向RHPLC 制备"研究活血中药抑制血小板聚集药效物质基础的新方法，可减少中药复方化学成分系统分离的巨大工作量，同时该项目的研究结果为复方质量控制和瓜蒌-薤白药理作用机理的研究提供实验依据和理论支持。

（1）通过小鼠凝血时间实验确定瓜蒌-薤白提取物抗凝血活性部位为大孔树脂柱水洗脱部分，体外抗血小板聚集实验提示大孔树脂柱水洗脱部分、95%乙醇洗脱部分具有直接抑制ADP或U46619诱导的血小板聚集的活性；采用血小板细胞膜，建立了一种基于GPCR-配体亲和作用垂钓抗血小板聚集活性成分的色谱技术-血小板细胞膜色谱，通过血小板细胞膜色谱与UPLC- QTOF-MS/MS联用的离线系统能够识别、富集、分离并鉴定作用于血小板膜受体上的潜在抗血小板成分。从瓜蒌-薤白提取物的抗凝血活性部位-大孔树脂水洗脱部分中富集了具有抗血小板聚集作用的多糖类成分，从粗多糖中分离并鉴定了一种新的多糖。证明多糖类成分是瓜蒌-薤白药对发挥抗凝血活性的重要物质基础。.（2）发表论文8篇（其中SCI文章2篇），申请相关专利2项。.（3）培养研究生2 名（毕业1名）。