新的简化基因组捕获技术的开发及其在湍蛙属物种系统关系解析上的应用

In recent years, animal molecular phylogenetic studies at small scale of evolution, such as within genus, among close-related species and intra-species, has become increasingly common. In such small evolutionary scales, traditional mitochondrial and nuclear genes normally can not provide enough information to resolve phylogenetic relationships of interested. Sequence capture and RAD-seq are two kinds of popular high-throughput sequencing methods for phylogenetic studies of recent years. However, the probes of sequence capture are very expensive, and the sequence capture method is generally suitable for higher-level phylogenetic studies; on the other hand, the RAD-seq method is only applicable for shallow-scale questions, such as among close-related species and intra-species. Currently, there is a lack of a universal high-throughput sequencing method to study phylogenetic relationships of distantly related species within a genus. To solve this problem, this project plans to use size-selected restriction fragments to generate home-made biotin probes, to develop a new simplified genome capture technology (we call it SIG capture). This method will become a new universal and inexpensive high-throughput method to resolve phylogenetic relationships of distantly related species within a genus. In addition, our project will use the SIG capture method to study the phylogenetic relationships of Amolops species of southeastern China, which will provide new insights for species validity, taxonomy, species group division of Amolops. We hope the SIG capture method will become a powerful tool for future phylogenetic studies of small scale of evolution.

近年来，动物分子系统学研究越来越集中在属下、近缘种间以及种下的小尺度范围内。在这些进化尺度下，传统的线粒体与核基因分析已经无法提供足够的信息。序列捕获与RAD-seq是近年来流行的两种高通量研究技术，但序列捕获的探针合成非常昂贵，且一般仅适用于高阶元的系统学研究，RAD-seq方法又只能在近缘种或种下水平应用，目前属内远缘物种间的系统关系研究目前缺少一种通用的高通量测序分析技术。针对这一问题，本项目拟通过限制性酶切片段长度筛选与生物素杂交探针的扩增制备，开发一种新的简化基因组捕获技术（SIG capture），使其成为适用于属内远缘物种间分子系统学研究的一种通用且经济的高通量研究方法。此外，本项目还拟利用SIG capture方法解析中国东南部湍蛙属物种间的系统关系，对其物种有效性、分类地位、种组划分等进行讨论，进一步证明SIG capture方法在解析属内远缘物种系统关系中的效能。

近年来，动物分子系统学研究越来越集中在属下、近缘种间以及种下的小尺度范围内。在这些进化尺度下，传统的线粒体与核基因分析已经无法提供足够的信息。序列捕获与RAD-seq是近年来流行的两种高通量研究技术，但序列捕获的探针合成非常昂贵，且一般仅适用于高阶元的系统学研究，RAD-seq方法又只能在近缘种或种下水平应用，目前属内远缘物种间的系统关系研究目前缺少一种通用的高通量测序分析技术。本项目创新性地将传统AFLP分析中的扩增多态性片段制备成捕获探针，开发了一种新的简化基因组捕获技术（AFLP-Capture）。由于AFLP探针捕获的区域多为基因组非编码序列，进化速率高，这使AFLP-Capture非常适用于属内远缘物种间分子系统学研究。在此基础上，我们对中国南方22个已知湍蛙物种的70个样本进行了AFLP-Capture测序，构建了迄今为止最为全面的湍蛙系统发育树，为湍蛙的分类研究和演化历史研究提供了框架与基础。此外，在本项目支持下，我们在自制捕获探针方向上进行了更多的探索，提出了自制混合PCR产物捕获探针进行杂交捕获的新方法，并基于该方法解析了鳞翅目凤蛾科系统发育关系并研究了其拟态进化历史。我们还用全外显子捕获技术对现生鼠兔的进化历史进行了研究，提出了现生鼠兔“走出西藏”的起源与进化新假说，发现了全球气候变冷是鼠兔物种多样性产生的重要驱动因素，突显了青藏高原作为寒冷适应哺乳动物起源摇篮的作用。在其他进化研究方面，我们首次通过进化分析的方法对蝮蛇红外感知相关基因进行全基因组调查，鉴定出一大批蝮蛇红外视觉相关候选基因，为阐明蝮蛇高度敏感的红外视觉产生的遗传基础与分子机制提供了新观点。4年来，在本项目的资助下共发表第一资助SCI论文6篇，分别发表在MBE（1篇）、MER（1篇）、MPE（2篇）、EE（1篇）、SR（1篇）上。总结来说，我们已经出色地完成了项目所设定的全部研究目标。