核受体NR6A1调节血管平滑肌细胞PTX-3旁分泌在动脉粥样硬化发生中的作用研究

Macrophages are the first inflammatory cells to invade atherosclerotic lesions, and they are the main component of atherosclerotic plaques. Patients with cardiovascular disease had higher levels of Pentraxin-3（PTX-3） in blood. We previously found that mRNA expression of PTX-3 was down-regulated by NR6A1. We further found that NR6A1 physically couple with AP-1. In this study, we sought to determine whether NR6A1 couples with AP-1, regulates Ptx-3 expression and affects development of atherosclerosis. The expression of NR6A1, PTX-3 will be determined by quantitative real-time RT-PCR and western blotting. To determine the biological function of NR6A1 in cells, a recombinant adenovirus expressing NR6A1-FLAG and siRNA targeting NR6A1 are used. The coupling of NR6A1 with AP-1 is determined by using immunoprecipitation and FRET assays. Chemotaxis of the macrophages is analyzed with a transwell system. C3 deposition is checked by using immunofluorescence staining for C3. The development of atherosclerosis in SM22-α-Nr6a1-/-apoE-/- mice will be analyzed by using en face oil O staining. This study will probably provide a new paracrine loop between smooth muscle cells and macrophages in the lesion of atherosclerosis.

单核-巨噬细胞在动脉粥样硬化（AS）中发挥重要作用，循环中的PTX-3与心血管事件密切相关，本项目前期发现核受体NR6A1可以结合AP-1蛋白，并抑制IL-1诱导的PTX-3表达。本项目将明确NR6A1是否通过结合AP-1抑制IL-1等诱导的平滑肌细胞（VSMC）PTX-3表达，并调节血管内旁分泌影响AS的发生。我们将研究VSMC中NR6A1-PTX-3基因表达调节；运用核受体与DNA相互作用技术研究NR6A1对PTX-3调节机制；运用免疫共沉淀、FRET及缺失突变技术，研究NR6A1与AP-1等分子的相互作用；运用细胞共培养技术明确VSMC中NR6A1-PTX3信号对巨噬细胞的趋化等生物学行为的影响；进而研究SM22-α-Nr6a1-/-apoE-/-小鼠粥样斑块中补体沉积、巨噬细胞侵润及AS的发展。本项目的完成将有助于发现新的AS斑块内旁分泌调节机制，促进对疾病的认识及发现新防治靶点。

动脉粥样硬化的主要病变特征为动脉内膜下脂质沉积，并伴有平滑肌细胞和纤维基质成分的增多，逐步发展形成动脉粥样硬化性斑块，导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果。发现这种病变的细胞及分子机制成为该领域研究的重点问题。核受体家族成员与机体脂肪代谢以及血管功能有密切关系，可以通过直接调节血管细胞功能，也可以通过影响全身或血管局部脂质代谢发挥重要的血管保护作用。本项目研究了孤儿核受体NR6A1的脂质代谢调节作用，以及血管平滑肌细胞功能调节作用及机制。. 本项目发现：NR6A1是PDGF-BB的靶基因，NR6A1影响平滑肌细胞迁移，也调节大鼠球囊损伤诱导的血管内膜新生；进一步研究发现NR6A1可以靶向调节迁移调节分子SPP1；在作用机制上证实NR6A1能够与细胞核内的结构蛋白Actin、以及RNA聚合酶2形成转录起始复合物。该转录复合物进一步与CREB蛋白结合，进而影响SPP1基因启动子上的CRE转录活性，从而调节了SPP1表达。以上数据提示：核受体NR6A1能够作为转录复合物的重要组分，通过结合并调节CREB信号传导，改变细胞迁移相关蛋白SPP1的表达，在调节血管平滑肌细胞迁移中发挥重要作用（已发表）。同时，NR6A1可以通过调节靶基因PTX-3的表达以及分泌，通过旁分泌机制影响平滑肌细胞迁移（投稿中）。. 此外，本项目证实NR6A1通过调节miR-205-5p表达，影响HepG2细胞中胰岛素受体以及脂质合成相关基因的表达，并依赖于mTORC1信号分子，调节HepG2细胞内脂质水平（已发表）。同时，发现NR6A1能够调节脂质代谢调节基因ANGPTL4的表达，而天然双酚类化合物厚朴酚可以通过NR6A1-ANGPTL4信号轴影响心肌细胞脂质代谢（未发表）。. 如上研究均提示核受体NR6A1是调节细胞脂质代谢的重要分子，NR6A1可能是一个新的动脉粥样硬化防治药物作用靶点，对相关疾病发病机制的认识拓展了新内容，对于理解脂质代谢与血管损伤交互作用机制提供了新理论。