NeuroD1在体直接转分化星形胶质细胞为神经元对大鼠慢性脊髓损伤治疗作用的实验研究

Chronic spinal cord injury, belong to nerve damage, is characterized by the formation of glial scar. Glial scar tissues seperate the damaged areas from the surrounding normal tissues, and secrete proteoglycan to inhibit axonal regeneration. Therefore, the existing treatments are ineffective. Although some progresses have been made in cell therapy, less cell survival after transplantation, poor integration with the host cell, so not regenerating axons often failed to cross the damage zone. In vivo direct transdifferentiation provides a new idea for the treatment of chronic spinal cord injury. Studies show that Neuregulin-1 could promote neuronal survival, migration, and growth of neurite to help axon to extend to the targeting region and synapses occur, as well as NeuroD1 could promote astrocytes in the brain to transdifferentionate into neurons. This project is intended to take the large sum of astrocytes existed in glial scar as cell source, and in vivo transfect NeuroD1 to chronic spinal cord injury lesion, to make astrocytes in vivo directly transdifferentiate into neurons, while in vivo transfect Neuregulin-1 to the upper and lower sections separately, prompting to make the in vivo transdifferentiated neurons contact with the in situ neurons. Through these studies, we could analyze the recovery of rats after direct transdifferentiation to provide new experimental reference for the treatment of chronic spinal cord injury.

慢性脊髓损伤是以胶质瘢痕形成为特点的神经损伤，胶质瘢痕将损伤区与周围组织隔开，同时其分泌的蛋白多糖抑制轴突再生，使现有的治疗手段难以奏效。近年来兴起的细胞疗法虽然取得一定进步，但移植后细胞存活量少，与宿主细胞的整合差，再生的轴突往往不能越过损伤区。在体直接转分化的兴起为慢性脊髓损伤的治疗提供了一个新思路，研究表明，Neuregulin-1能促进神经元的存活、迁移和突起的生长，有助于促进神经轴突向靶向区域的扩展以及突触的发生，NeuroD1可以将脑部的星形胶质转分化为神经元。本课题拟以胶质瘢痕中大量存在的星形胶质细胞为细胞来源，在体转染NeuroD1到慢性脊髓损伤病灶区，使星形胶质细胞在体直接转分化为神经元，同时在损伤上下节段转染Neuregulin-1，促使在体直接转分化的神经元与原有神经元形成突触联系，分析直接转分化后大鼠的恢复情况，为慢性脊髓损伤的治疗提供新的实验参考。

随着世界各国经济水平的发展，同时带来脊髓损伤的发生率呈现逐年增高的趋势。慢性脊髓损伤是以胶质瘢痕形成为特点的神经损伤，胶质瘢痕将损伤区与周围组织隔开，同时其分泌的蛋白多糖抑制轴突再生，使现有的治疗手段难以奏效。近年来兴起的细胞疗法虽然取得一定进步，但移植后细胞存活量少，与宿主细胞的整合差，再生的轴突往往不能越过损伤区。在体直接转分化的兴起为慢性脊髓损伤的治疗提供了一个新思路，研究表明，Neuregulin-1能促进神经元的存活、迁移和突起的生长，有助于促进神经轴突向靶向区域的扩展以及突触的发生，NeuroD1可以将脑部的星形胶质转分化为神经元。.本项目的主要研究内容：在体外直接转分化脊髓源星形胶质细胞为神经元，并建立体外突触形成模型，检测体外突触形成情况；建立慢性脊髓损伤模型，体内转染 NeuroD1 研究脊髓胶质瘢痕内星形胶质细胞的在体直接转分化情况；比较单纯转染 NeuroD1 组与损伤区转染 NeuroD1 损伤上下节段转染 Neuregulin-1 组对慢性脊髓损伤的治疗作用的区别；通过电生理检测，行为学评分，组织切片后免疫染色分析验证在 体直接转分化对慢性脊髓损伤的治疗作用。.体外成功分离培养及扩增大鼠脊髓来源的星形胶质细胞，并采用腺相关病毒pAOV-CMV-EGFP-3FLAG包装载体，将靶基因NeuroD1装载到腺相关病毒pAOV-CMV-EGFP-3FLAG包装载体中，构建pAOV-CMV-Neurod1-EGFP-3FLAG病毒。用病毒感染原代培养的脊髓源星形胶质细胞，观察到有少量胶质细胞表达神经元标记物。同时通过构建慢性脊髓损伤模型，术后4周在原手术部位注射pAOV-CMV-Neurod1-EGFP-3FLAG病毒，在注射病毒后2/4/6周灌注固定取材。结果表明，经real-time PCR检测PSD95的mRNA含量略有上升，免疫荧光结果检测表明，Tuj-1的表达略有增加，GFAP略有减少，PSD-95，NF200等突触表达蛋白的表达较弱，实验结果具有一定参考意义。.本项目旨在初步了解在体原位直接转分化后星形胶质细胞在慢性脊髓损伤中的治疗作用，研究成果将有利于推动在体直接转分化的研究，为慢性脊髓损伤的治疗提供新的实验参考，从而为慢性脊髓损伤和其它中枢神经系统疾病治疗提供基本的实验数据。.