类风湿性关节炎伴发骨折模型构建及愈合模式观察与机理研究

Bone fracture due to Rheumatoid Arthritis(RA) induced osteoporosis is not uncommon.How to evaluate the influence of inflammatory condition on bone healing is of great importance ,which may affect the selection of therapeutic strategy for the treatment of bone fracture.However, no reported reseach is available about this issue at current stage.In this reseach, Wistar rats will be used to creat RA model (Collagen induced arthritis) to simulate the pathological state of fractures in RA patients.Radiology,histology,biomechanics,histomorphometric as well as molecular biological techniques will be used to evaluate the bone healing mode.Then, the bone mesenchymal stem cells(BMSCs) derived from "RA+fracture" model will be used and the osteogenesis and chondrogenesis of these cells will be verified,and the BMSCs drived from RA model, bone fracture model and normal Wistar rats will be evaluated as well.This research will provide pre-clinical support data for the treatment of bone fracture in RA patients in clinics .

类风湿性关节炎（RA）导致的骨质疏松容易引起骨折。在发生骨折后如何评估RA炎症状态对于骨折愈合的影响直接关系到骨折治疗策略的选择。而目前未见相关报道。基于此，本项目以Wistar 大鼠的RA 模型(胶原诱导关节炎)为研究对象，通过构建"RA+骨折"模型模拟临床RA 病人骨折后的发病状态，通过运用影像学、组织学、生物力学检测、形态计量学以及分子生物学等手段在动物体内分析"RA+骨折"模型在骨折愈合不同阶段的形态学、生物力学及生物学特点，单纯骨折模型作为对照。通过对"RA+骨折"模型来源骨髓基质干细胞的成骨及成软骨分化特性的分析，揭示炎症状态对于骨折愈合的影响机制，同时检测单纯RA,单纯骨折以及正常大鼠来源骨髓基质干细胞的成骨及成软骨分化特性。本项目关于RA伴发骨折模型愈合模式及机理的探讨有望为临床同类疾病的治疗提供重要的临床前实验支持。

本项目基于类风湿性关节炎（RA）患者容易发生骨折且骨折后难以愈合的机理展开研究。探讨RA炎症状态下对骨折愈合的影响及其作用机理。分别从体外和体内层面进行了初步的研究。体外方面：构建RA伴发骨折大鼠模型，同时正常大鼠骨折模型作为对照。在骨折后分离培养培养骨髓基质干细胞（BMSC），添加炎症因子TNF-α和IL-1刺激BMSC细胞，用CCK8法进行细胞毒性和增殖分析，茜素红染色、碱性磷酸（ALP）活性检测、骨钙素（OC）分泌量、聚合酶链反应（PCR）、Western Blot（WB），阿尔新兰等检测方法进行成骨/软骨化诱导分析。动物体内方面：模型构建成功后4和8周进行放射学X-RAY、Micro-CT分析。组织学：H&E染色、翻红O染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色等分析。研究结果发现炎症刺激BMSC细胞后对其增殖影响不大。通过检测一系列成骨/成软骨的标志物来深入研究炎症因子对骨髓间充质干细胞分化的影响。结果表明添加TNF-α（50ng/ml）和IL-1（10ng/ml）这两种炎性因子能明显抑制成骨的标志基因OPN、ColⅠ和成软骨标志基因Agg、ColⅡ的表达，对成骨标志基因OC却有一定得促进作用。添加炎性因子能明显降低碱性磷酸酶的活性，从而抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。用ELISA方法检测成骨诱导8天后培养液上清中骨钙素的含量，结果显示添加炎性因子组的含量要高于对照组，与前面PCR的结果也一致。通过Western Blot的分析，进一步验证实验结果，添加炎性因子会降低大部分成骨标志蛋白OPN,Runx2和成软骨标志蛋白Agg和Sox9的表达量，OC除外。最后通过茜素红染色和阿尔新兰染色更直观的显示出添加炎性因子对BMSC成骨和成软骨分化都存在抑制作用。动物实验表明RA引起骨质疏松并在炎症状态下骨折较难愈合。据本研究成果，可为临床医生对RA患者伴发骨折手术后的抗炎用药及手术方案的制定提供借鉴作用，具有良好的研究意义。