基于表位掩蔽和构象折叠理论的糖基化修饰降低OVA致敏性的分子机制

The preliminary study found that glycosylation can greatly reduce the sensitization of ovalbumin (OVA), which is closely related with the epitope masking and conformation changing, but its molecular mechanism is not clear. According to this scientific problem, this project aims to monitor the glycosylation between OVA and glucose under mild conditions from three aspects (modification sites, the dgree of modification and conformational change), which is based on the theory of epitope masking and conformation folding. Then we analyse the sensitivity of glycated OVA, the ability of binding with IgG/IgE, by Elisa; explore the change rules of advanced conformation and calculate the degree of polymerization by means of MALDI MS, ultraviolet spectrometry, fluorescence spectrometry, circular dichroism spectroscopy, HDX-MS; determine the glycosylation site and the degree of modification of qualitatively and quantitatively by using Orbitrap LC-MS, 18O isotope labeling and other methods; reveal the relationship between the modification sites, advanced conformation and Allergic reaction according to the 3D structure of OVA; finally, we will elaborate the intrinsic mechanism of glycosylation modification to reduce OVA allergen from the aspects of linear epitope masking and conformation folding, to lay a theoretical foundation for the directional modification of the desensitized protein.

前期研究发现，糖基化修饰可以大大降低卵清蛋白（OVA）的过敏性，且与表位掩蔽和构象变化密切相关，但是其内在分子机制尚不清楚。针对这一科学问题，本项目拟基于卵清蛋白的表位掩蔽和构象折叠理论，分别从糖基化修饰位点、修饰程度和构象变化的角度出发，以OVA和还原单糖为研究对象，采用温和条件进行糖基化修饰，并监测其修饰程度；通过ELISA方法分析糖基化OVA的过敏性（IgG/IgE 结合能力）；利用MALDI MS、紫外、荧光、圆二、HDX-MS等方法分析糖基化OVA的聚合度和高级构象变化；采用Orbitrap LC-MS、18O稳定同位素标记等手段对糖基化修饰位点和修饰程度进行定性和定量分析；结合OVA的3D结构和过敏表位，揭示糖基化修饰位点-修饰程度-高级构象-过敏性之间的关系，从线性表位掩蔽和构象折叠方面阐述糖基化修饰降低OVA过敏性的内在机制，为低敏或脱敏蛋白的定向修饰和开发奠定理论基础。

鸡蛋是人们日常饮食中的一种高质低价的蛋白源，其不仅含有人体必需的8种氨基酸，而且含有婴幼儿时期人体不能自身合成的组氨酸，然而，鸡蛋也是最常见的过敏食物之一，如何降低鸡蛋蛋白过敏性是目前国内外研究的热点和焦点。本项目研究发现糖基化修饰可以大大降低卵清蛋白（OVA）的过敏性，且与过敏表位掩蔽和构象变化密切相关，但是糖基化修饰降低蛋白质过敏性的内在分子机制尚不清晰。本项目以OVA为研究对象，在温和条件下与D-核糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖和D-果糖五种单糖进行糖基化反应，探究了不同单糖的糖基化活性差异为D-核糖≈D-木糖＞D-半乳糖＞D-葡萄糖＞D-果糖；通过单因素实验和正交实验确定了低致敏性OVA的最佳糖基化修饰工艺条件；研究发现了单糖修饰会使OVA的致密球蛋白结构展开、松散，引起蛋白质的去折叠；单糖的构型、碳链长度和羰基类型对其糖基化活性有显著影响，单糖碳链中C-4处的羟基构型差异可能对单糖的糖基化活性有显著影响。通过对低敏性糖基化OVA的构象结构和糖基化修饰位点分析，揭示了糖基化降低OVA致敏性的分子机制有四点，一是糖基化可以诱导OVA结构紊乱并引起β-转角和无序卷曲含量减少，从而减弱了OVA与IgG和IgE结合，降低了其致敏性；二是糖基化可能会通过破坏OVA的三级结构而影响其构象表位的完整性；三是糖基化会降低OVA表面疏水性，减弱OVA分子中疏水性作用，从而削弱抗体和抗原之间的相互作用强度；四是糖基化进一步掩盖随着构象变化而从内部疏水核心暴露的线性表位，最终导致OVA致敏性的降低。该项目的研究结果完善了糖基化蛋白质的表位屏蔽理论，为低敏或脱敏蛋白的定向修饰和研发提供了理论指导，为新型安全食品原料的开发提供了理论依据。