聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白的结合位点、构象变化与致敏性间关系研究

β-lactoglobulin (β-Lg) is a major allergen causing milk allergy, reducing its allergenicity by covalent conjugation has been a research hotspot in international dairy processing area. However, several problems exist in covalent conjugation such as multiple conjugation sites and complexity of modification products, causing unclear relationship between conjugation site, conformation change and allergenicity of β-Lg. In this project, N-terminal, ε-NH2 of Lysine, glutamine and thiol group of β-Lg will be intended to be modified. Softwares such as Gromacs will be used to model and select the threshold of PEG molecule size that can react with thiol group of β-Lg. Based on such PEG, specific-site PEGylation will be applied to modify sites. The resulting products will be purified by AKTA protein purification system and verified by techniques such as electrophoresis, RP-HPLC, SEC-HPLC, then conjugation site will be determined by peptide mapping, amino acid anlysis, MALDI-TOF-MS and NMR. Conformation changes due to PEGylation will be investigated by SEM, AFM, particle size analyzer, surface sulfhydryl group/surface hydrophobicity, circular dichroism spectrum, fluorescence spectrum, and two-dimensional NMR. The change of allergenicity will be analyzed by indirect competitive ELISA and Western blotting. The effect of PEGylation site on conformation of β-Lg will be discussed by theoretical derivation and molecular simulation, and relationship between conjugation site, conformation change and allergenicity of specific-site PEGylated β-Lg will be further illustrated. This project will provide the theoretical principle for effective regulating the allergy of β-Lg.

β-Lg是牛奶的主要过敏源，采用共价修饰降低其致敏性已成为国际乳制品加工研究的热点。然而共价修饰存在修饰位点多，产物复杂等问题，造成共价结合位点、构象变化与致敏性间关系不明。本项目拟修饰β-Lg的N-末端氨基，赖氨酸的ε-NH2、谷氨酰胺残基及巯基，通过Gromacs等软件模拟筛选能与巯基结合的临界PEG分子量，选择该分子量PEG，采用PEG定点修饰技术分别修饰各位点；AKTA系统纯化后，采用电泳、反相高效液相、分子排阻色谱等技术鉴定；肽谱、氨基酸分析、MALDI-TOF-MS以及核磁共振解析结合位点；扫描电镜、原子力显微镜、粒度仪、表面疏水性/巯基测定、圆二色谱、荧光光谱、二维核磁等表征构象变化；间接竞争ELISA和SDS-PAGE免疫印迹法分析致敏性变化；理论推导结合分子模拟探讨修饰位点对构象的影响，进一步阐明结合位点、构象变化与致敏性间的关系，为β-Lg致敏性的有效调控提供理论基础。

β-乳球蛋白含有多种人体必需氨基酸，是一种优质的蛋白质，但是同时也是牛乳中主要的过敏原之一，可以通过消化到进入体内产生过敏反应。使用共价修饰的方法降低β-乳球蛋白的致敏性由于具有诸多优点而成为科学领域关注的热点问题。使用聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白，可以克服随机修饰存在的修饰位点过多，产物不均一，结构变化与结合位点之间的关系不明了的问题。本项目通过对β-乳球蛋白的不同基团（N-末端氨基、谷氨酰胺残基、巯基、羧基）进行定点修饰，得到不同修饰位点以及不同修饰度的修饰产物，探索不同修饰基团对其致敏性以及构象变化的影响。选择合适的PEG对修饰条件进行优化制备出修饰产物之后采用阳离子交换柱分离纯化，使用SDS-PAGE和MALDI-TOF/TOF进行鉴定，随后采用间接竞争ELISA法对致敏性进行测定。实验结果表明，共价修饰β-乳球蛋白修饰位点不同，对其致敏性影响不同：β-乳球蛋白的N-末端氨基、谷氨酰胺残基、羧基定点修饰产物致敏性显著下降，而巯基修饰产物的致敏性明显升高。此外，我们针对N-末端氨基和巯基使用了不同分子量的PEG进行修饰，发现氨基修饰时PEG分子量越大，致敏性降低越多；而巯基修饰时，PEG分子量越大，致敏性升高幅度越小。表明PEG分子量与致敏性变化有很大相关性。在对羧基修饰时，制备出两种不同修饰度的产物，结果表明，修饰度越高致敏性降低越大，证明结合的PEG数目对致敏有很大的影响。为明确致敏性变化与结构变化的关系，我们对修饰产物的二三级结构进行检测，发现不同的修饰二级结构和三维空间构象暴露程度发生一定的变化。在此基础上，我们使用酶解肽段以及三维结构推测的方法对各个修饰方法的修饰位点进行鉴定，发现修饰位点与结构变化、致敏性变化存在一定的相关性。本项目研究发现了β-乳球蛋白修饰位点不同、PEG修饰物分子量不同，以及结合的PEG数目不同均能对蛋白致敏性造成不同影响，并且采用定点修饰技术对不同位点进行修饰能为实现β-乳球蛋白致敏性有效调控提供理论基础。