基于表位加工控制鸡蛋卵类黏蛋白致敏性的研究

Ovomucoid is the immunodominant allergen in hen egg white. It is difficult to handle in hypoallergenic egg production because of its stability to heat and enzymatic hydrolysis, and at present no method of processing is found to be ideal to eliminate or greatly reduce allergenicity of ovomucoid. This project aimed at the immune epitopes, and the IgE binding capacity of ovomucoid should be controlled as following: the disulfide bonds were reduced to destroy the conformational epitopes；glycation was performed to modify the linear epitopes, and then refolding was induced to bury some linear epitopes. On the basis of in vitro allergenicity assessed with inhibition ELISA and western-blotting, the prepared low IgE binding ovomucoid was processed in simulated gastrointestinal fluids to evaluate its digestibility, and animal model evaluation was also performed. . This project would clarify relationship between allergenicity and the changes of ovomucoid, including conformation, glycation sites and digestibility. Moreover, allergenicity basis of ovomucoid would be further clarified. It is expected for providing the theoretical guide in preparation of hypoallergenic ovomucoid, and hopefully applied to non-allergenic egg products development.

卵类黏蛋白是鸡蛋清中致敏性最强的过敏原，它耐热、耐酶解，是脱敏鸡蛋产品研发中的一大难点，至今尚无大幅度降低/消除卵类黏蛋白致敏性的理想加工方法。本项目从过敏反应的物质基础—致敏性表位入手，通过还原二硫键破坏构象性表位后，借助糖化反应修饰卵类黏蛋白的线性表位，再利用诱导重新折叠包埋部分线性表位，可望有效降低它与鸡蛋过敏患者血清的IgE结合能力。然后，在竞争抑制ELISA和western-blotting进行体外致敏性评估的基础上，采用模拟的胃肠液测定该低IgE结合能力产物的耐酸及耐酶解能力，完成消化性评估；最后，采用该产物免疫小鼠，完成动物实验的相关免疫学评估。.通过该研究，旨在阐明卵类黏蛋白构象变化、糖化位点及消化性与致敏性的关系，进一步揭示卵类黏蛋白的致敏性变化规律，可望为卵类黏蛋白致敏性的消减提供理论指导，并期待成功应用于脱敏鸡蛋产品的研发中。

目的：通过食品级加工技术获得低致敏卵类粘蛋白产物，为低致敏或脱敏鸡蛋产品的研发提供理论指导。.主要研究内容：1. 卵类粘蛋白的分离纯化；2. 卵类粘蛋白的去折叠与烷基化处理：采用谷胱甘肽还原法和半胱氨酸还原法破坏分子内二硫键。在检测前先通过烷基化反应屏蔽巯基，并利用离心浓缩除去过量反应物使结果更精确；3．美拉德反应影响卵类粘蛋白致敏性条件的优化，将反应条件最优的卵类粘蛋白产物用于下一步研究；4．糖化卵类粘蛋白免疫反应性的评估： ELISA检测去折叠前后卵类粘蛋白的兔血清IgG结合能力和鸡蛋过敏患者血清IgE结合能力5．动物实验评估卵类粘蛋白产物致敏性：用低IgE结合卵类粘蛋白产物免疫小鼠，通过观察小鼠过敏症状、检测致敏小鼠血清中抗体的水平、检测脾细胞细胞因子水平的变化等完成动物实验评估。.重要结果：1.建立了高免疫活性的卵类粘蛋白的分离纯化方法及一步法分离鸡蛋清中四种主要过敏原的方法.2．最佳还原条件：选择谷胱甘肽作为还原剂，还原剂浓度为1mg/ml时，产物与小鼠血清IgG及人血清IgE结合能力下降最显著。.3．去折叠卵类粘蛋白结构变化：二级结构发生改变，主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。.4．最佳糖化条件：麦芽糖与卵类粘蛋白赖氨酸残基比例为10：1，加热温度为90℃，加热时间为8 h时，与兔血清IgG结合能力结果显示该糖化条件加工后的卵类粘蛋白（G-M-OVM）的IC50值由0.3741μg/ml上升到112.6μg/ml，与过敏患者血清IgE结合能力检测结果显示G-M-OVM相比于未加工的卵类粘蛋白（OVM）IgE结合能力显著下降（P＜0.05）。.5．卵类粘蛋白的重新折叠：诱导重新折叠的卵类粘蛋白未完全在原来的位置发生折叠。.6．动物实验评估：小鼠血清特异性抗体IgE、IgG、IgG1和IgG2a水平相比于未加工的卵类粘蛋白组小鼠均下降（P＜0.05）。加工后的卵类粘蛋白刺激脾脏产生的IL-4，IL-17A和IFN-γ的水平均下降（P<0.05）。.关键数据科学意义：建立了一种通过食品加工技术有效降低鸡蛋顽固致敏原卵类黏蛋白致敏性的方法