替加环素耐药鲍曼不动杆菌RND外排系统调控的分子机制研究

我们监测数据表明碳靑霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）逐年上升，作为治疗CRAB最后防线之一的替加环素的不敏感率至少10%。我们前期研究发现外排系统高表达与替加环素耐药相关，但其表达调控的机制不明。为证实"三种RND外排系统（AdeABC、AdeIJK、AdeFGH）受局部和整体调控子直接或间接调控"这一假设，本项目拟在所选定的流行ST92克隆株基础上，结合基因敲除、比较转录组学、经典的分子生化实验等，研究各调控子（AdeR、AdeL、SoxR、MarR）对这三种外排系统转录调控的精细分子机制；随后，采用序列分析、遗传修饰、RT-PCR等研究临床株中各调控子规律性的遗传变异对外排系统表达水平、耐药表型的影响，探明调控子-靶基因调控环路的遗传重塑在泛耐药中所起的作用。通过此研究，系统深入阐明替加环素耐药形成和发展中，基因表达调控的确切分子机制，为寻找治疗泛耐药鲍曼不动杆菌的靶标药物提供线索。

监测数据表明碳靑霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）逐年上升，作为治疗CRAB 最后防线之一的替加环素的不敏感率也逐年上升。前期研究发现外排系统高表达与替加环素耐药相关，但其表达调控的机制不明。本项目检测了RND外排泵基因adeABC、adeFGH和adeIJK和外排泵调控基因SoxR和MarR的表达情况。结果显示替加环素耐药菌株中RND外排泵基因adeABC和adeIJK的表达水平明显高于敏感菌株。adeFGH在检测的替加环素耐药和敏感菌株中没有明显差异。整体调控子基因SoxR和MarR在敏感株中表达高于替加环素不敏感株。此外，我们还对替加环素在临床常见多重耐药菌体外抗菌活性进行了研究，并对替加环素对鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌体外抗菌活性检测的影响因素和方法学进行了评估。我们利用基因敲除和基因回补技术，构建了外排泵基因adeB的缺失突变株、回补株，并进行了耐药表型和比较转录组分析。比较转录组分析共发现27个差异蛋白，包括21个酶，3个膜蛋白和3个未知功能的分子。我们还发现8个转录调控相关分子在缺失突变株中上调，但在回补株中表达下调，与替加环素的MIC值变化趋势正好相反，可能与替加环素耐药相关。我们分别选取两组典型菌株：对替加环素高度敏感和高度耐药的鲍曼不动杆菌，分析调控子基因adeR、adeS、SoxR和MarR编码区的DNA序列。比较敏感株与耐药株间的相应DNA 序列，发现在两组菌株中规律分布的变异位点。利用遗传修饰回补耐药相关突变，耐药表型分析结果显示，adeR或adeS回补株仅微弱降低鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性 (≤2-fold)。另外，我们还对32株碳氢酶烯耐药和3株敏感菌株进行全基因组测序和比较基因组分析，发现了我国碳氢酶烯耐药鲍曼不动杆菌的进化特点，揭示了院内CRAB 传播的遗传学基础。综上，我们阐明了替加环素耐药形成和发展的分子机制，为寻找治疗泛耐药鲍曼不动杆菌的靶标药物提供线索。