RND型外排泵在鲍曼不动杆菌克隆复合体22多重耐药中的作用

多重耐药鲍曼不动杆菌（MDRAB）呈世界性流行，成为全球抗感染治疗的挑战，我国尤为严重。外排泵过度表达在介导细菌多重耐药中发挥关键作用，特别是RND型外排泵。前期研究中我们识别了克隆复合体22（CC22），发现其是我国最主要的MDRAB流行株，同时在全球播散。并且，CC22对各类抗菌药物的耐药性均高于其他克隆复合体菌株，基因组分析提示CC22在包括外排泵在内的耐药基因数量和种类上与其他克隆菌株并无差异，其更强的耐药性极可能由其携带的RND型外排基因过度表达所致。本研究根据CC22菌株ZJ06全基因组序列，采用外排泵抑制剂抑制试验、实时荧光定量PCR、基因敲除、序列分析、抗菌药物体外诱导实验对CC22中主要RND型外排泵及其调控基因进行研究，阐明主要RND型外排泵在CC22多重耐药中的作用，揭示调控基因突变对主要RND型外排泵表达的影响，为MDRAB的防控和治疗提供基础。

本研究对鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药机制进行了研究。利用PCR技术对RND型外排泵基因在鲍曼不动杆菌中的分布、利用PaβN进行了外排泵抑制剂抑制实验、利用qPCR检测外排泵AdeABC、AdeFGH和AdeIJK在转录水平表达情况，发现adeABC外排系统包括调控基因adeS、adeR在鲍曼不动杆菌广泛存在；PaβN对替加环素的MIC50，MIC90无影响；替加环素的耐药组和非耐药组AdeB的表达率差异有显著性。PCR扩增双组份调节系统AdeRS和转录调节因子AdeL并测序，寻找多态性位点和IS插入序列，在AdeABC高表达菌株中发现了AdeS的ISAba1插入突变。AdeL中未发现突变位点。通过研究证明了AdeABC高表达在碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌替加环素耐药机制中发挥重要作用，主要是其调控基因AdeS中存在ISAba1插入突变所致。利用ATCC19606为原始菌，进行体外诱导，获得替加环素耐药菌株19606-T8。利用RT-PCR进行表达量测定，未发现已知RND型外排泵的高表达。利用二代高通量测序技术对ATCC19606和19606-T8进行全基因组测序，在替加环素耐药菌株19606-T8中共发现四个突变位点。发现4个突变位点。利用酶切克隆的方法构建四个突变基因的野生型表达质粒pWH-trm, pWH-msbA, pWH-lolA 和 pWH-filC，再分别将该野生型质粒回补至替加环素耐药菌株19606-T8中，并进行替加环素MIC检测，发现msbA、lolA和filC 野生型基因在替加环素敏感性降低菌株T8中不能回复替加环素的敏感性；而trm野生型基因可以回复替加环素的敏感性，说明trm在替加环素耐药中发挥重要作用。Trm基因突变不影响细菌生长曲线。该课题明确了调控基因AdeS中存在ISAba1插入突变所致AdeABC高表达在鲍曼不动杆菌替加环素耐药机制中发挥重要作用。首次识别并明确了Trm基因在替加环素耐药中的作用。