ARHGAP24基因在肺癌侵袭和转移中的作用及机制研究

Lung cancer is one of the most common malignant tumors with more than 1 million diagnoses and deaths per year worldwide. Lung cancers harboring specific driver mutations are sensitive to targeted drugs, which benefits lung cancer patients. Previous study showed that 90% of lung adenocarcinoma patients from Chinese never smokers and 65% smoker patients harbored a driver mutation involving EGFR, HER2, ALK, KRAS, ROS1 or RET. All these known driver mutations have corresponding targeted drugs, some of them(Gefitinib, Erlotinib and Crizotinib) have shown significant benefit for patients harboring specific mutations. However, about 35%-50% of unselected lung adenocarcinomas and most lung squamous cell carcinomas from all comers (smokers and never smokers) do not harbor a knowndriver mutation. So far, we have found the low expression of suppressor gene ARHGAP 24 in lung cancer.In this study,through vivo and vitro experiment we will further explore the function and mechanism of ARHGAP24 gene in the genesis, development, invasion and metastasis in lung cancer.

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例和死亡病例都超过100 万。中国人群90%的不吸烟和65%的吸烟肺腺癌患者肿瘤有EGFR,HER2,ALK,KRAS,ROS1 或RET 基因突变中的一种,这些突变都有对应的靶向药物，部分已经在临床上取得很好的疗效。但肺腺癌总体上有35%-50%的病例没有已知的致癌基因改变，肺鳞癌已知的致癌基因改变相对更少，这部分患者目前没有机会接受靶向治疗。在前期研究中，我们发现抑癌基因ARHGA24在肺癌组织中表达明显降低，ARHGA24基因抑制有望作为新的致癌基因改变并成为新的治疗靶点。本课题以高通量测序和生物信息学筛选为基础，通过临床样本验证和分析确定肺癌的候选抑癌基因ARHGAP24，并将在体外实验和体内实验两个层面上探讨ARHGAP24基因在肺癌发生和发展、侵袭、转移等生物学行为中的作用及相关机制。

酶激活蛋白家族在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，但其生物学功能及作用机制仍不明确。通过实时定量PCR、免疫组织化学或免疫印迹法检测RhoGTP 酶激活蛋白24（ARHGAP24）、MMP9, VEGF, b-catenin，WWP2, p27, p-STAT6 和STAT6的在肺癌中的表达及 RhoA 和Rac1的活性；通过体外损伤修复试验检测-catenin抑制剂作用后，ARHGAP24在A549及NCI-H1975细胞调节肺癌细胞迁移及浸润的机制；通过流式细胞术进行细胞增殖、调往及细胞周期研究；通过裸鼠试验检测肺癌肿瘤细胞生长状态；通过免疫共沉淀及泛素化检测 WWP2和p27的联系。研究发现ARHGAP24在肺癌组织中表达下调，ARHGAP24过表达抑制肺癌细胞增殖。体外损伤修复试验显示pLVX-Puro-ARHGAP24的转染相较空白载体降低了迁移能力。ARHGAP24 过表达抑制了A549细胞中MMP9, VEGF and -catenin的表达。NCI-H1975 转染pLKO.1-ARHGAP24-shRNA相较pLKO.1-scramble shRNA显著降低了ARHGAP24 mRNA 及蛋白表达。-catenin 抑制剂XAV-939处理的转染了pLKO.1-scramble shRNA 的NCI-H1975 细胞相较未用抑制剂组被显著抑制了迁移。ARHGAP24过表达在G0-G1期诱导细胞周期阻滞，A549和NCI-H460细胞凋亡。A549和NCI-H460细胞中ARHGAP24过表达明显抑制了STAT6信号的激活。pLVX-Puro-ARHGAP24或空白pLVX-Puro载体转导的A549细胞后皮下注射入裸鼠体内，ARHGAP24过表达抑制裸鼠肿瘤生长。ARHGAP24敲低通过激活STAT6信号通路促进NCI-H1975细胞的增殖和WWP2的表达。上调WWP2可促进细胞增殖，抑制G0-G1期细胞周期阻滞和P27的表达。过表达WWP2后，P27的mRNA水平并没有发生变化，而WWP2过表达显著促进了A549细胞中P27的泛素化。综上所述，ARHGAP24通过STAT6-WWP2-P27轴调控肺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期进展，ARHGAP24沉默通过激活β-catenin信号通路促进肺癌细胞迁移和侵袭。