极端嗜盐古菌盐胁迫相关非编码RNA的鉴定和调控机制研究

Non-coding RNAs (ncRNAs) play vital roles in all three domains of life, i.e. Eukarya, Bacteria and Archaea. They participate in many different basic biological processes in the cell including transcriptional regulation, RNA processing, translational regulation. A great diversity of ncRNAs with different roles have been intensely studied in eukaryotic and bacterial model organisms, but few attempts have been performed so far to identify novel ncRNAs in the domain of Archaea. Using strand-specific RNA sequencing and small RNA sequencing methods, this project will identify the genome-wide ncRNA in the haloarchaeon Haloferax mediterranei whose whole genome has been sequenced by our lab. The ncRNAs in response to salt stress will also be identified and confirmed by Northern analysis. Furthermore, this project will construct ncRNA gene deletion mutants and research the regulation mechanism of ncRNAs with microarray analyses. Taken together, this project will provide basic information for the research of ncRNAs in the haloarchaea and provide novel methods and insights in gene regulation mechanism of ncRNAs.

非编码RNA在细菌、古菌及真核生物中均发挥着至关重要的作用，他们参与了细胞内多种基础生物过程，包括转录调控、RNA加工、翻译调控等。科学家们已经在真核生物和细菌中鉴定了大量非编码RNA，但是古菌中鉴定新非编码RNA方面的研究却很少。本项目以自主完成全基因组序列测定的极端嗜盐古菌- - 地中海富饶盐杆菌为研究对象，通过链特异性RNA-seq和小RNA测序来鉴定其基因组范围内的非编码RNA；通过不同盐浓度样本的比较来鉴定与盐胁迫相关的非编码RNA，并通过Northern Blot加以验证；构建非编码RNA基因缺陷型菌株，利用Microarray分析探索非编码RNA参与基因表达调控的机制。本项目将为嗜盐古菌非编码RNA的研究提供基础数据，并为后续非编码RNA对基因调控机制的研究提供新的思路和见解。

本项目以地中海富饶盐杆菌（现称地中海富盐菌）为研究对象，通过RNA-seq高通量测序，结合分子生物学和生物信息学分析等对其可能的非编码RNA（ncRNA）进行了分析和鉴定，探讨了与高盐响应等相关的ncRNA功能，完成了预期目标。首先完成了不同盐浓度诱导的地中海富盐菌的链特异性RNA测序（ssRNA-seq）和20%盐浓度样本的5’端差异RNA测序（dRNA-seq）；基于全基因组信息和ssRNA-seq和dRNA-seq数据，进一步确定了转录单元，成功鉴定到105个高可信度的ncRNA，包括44个反义链ncRNA（asRNA）和61个基因间区ncRNA（incRNA），大部分incRNA的长度位于100-300nt范围内。对asRNA在靶基因位置上的分布进行分析发现，asRNA大部分靠近靶基因两端。KEGG聚类分析发现，Protein export和Bacterial secretion system类别具有富集显著性（P<0.05），暗示了asRNA有可能通过调控细胞膜上各种转运蛋白来影响地中海富盐菌对不同盐浓度的应答。在不同盐浓度下表达差异超过2倍的ncRNA有45个，表达差异超过5倍的有4个。选取5个代表性ncRNA进行Northern杂交实验，确认了相关ncRNA的鉴定结果。有意思的是，首次发现incRNA1436有两个转录本，并且在不同盐度下存在差异表达，显示了ncRNA表达调控的复杂性。成功构建了incRNA0723、incRNA1436和incRNA2807等的敲除株，发现在低盐胁迫下，incRNA1436敲除株的延滞期较长，而适应低盐环境后，incRNA1436敲除株显现出良好的生长状态，达到稳定期时，菌体浓度甚至高于出发菌株DF50。需特别强调的是，在西班牙盐盒菌CRISPR-Cas系统cas基因间区（CIR）也发现了编码ncRNA的基因，基因敲除实验等暗示该ncRNA可能对CRISPR-Cas系统的稳定性维持具有重要意义，相关机制还待深入研究。综上所述，我们建立了地中海富盐菌ncRNA信息库和盐胁迫相关ncRNA信息库，发现或验证了部分ncRNA的新功能。高可信度ncRNA的鉴定，为今后全面开展嗜盐古菌ncRNA的功能机制提供了基础数据及重要的切入点，较好地完成了项目预定目标。