芳樟醇抑制奶牛子宫内膜炎致病性大肠杆菌生物被膜c-di-GMP信号通路的机制研究

Biofilm is a highly organized and systematic microbial membrane polymer formed by bacteria adhering to the surface of biological carriers or non-biological carriers. The biofilm of pathogenic bacteria enhances bacterial resistance and the ability of evading host defense system, and can lead to repeated infection. Our research team have isolated a pathogenic strain Escherichia coli D5, with multiple drug resistance and strong biofilm-forming ability, from the uterine mucus of dairy cow with endometritis. It was found that essential oil of Cinnamomum camphora and its main component linalool could significantly inhibit the biofilm of Escherichia coli D5. As a brand new second messenger widely existing in bacteria, c-di-GMP regulates the synthesis of bacterial flagella and fimbriae and the secretion of extracellular polysaccharide. It is an important factor to regulate bacteria to switch from planktonic state to biofilm state. In order to reveal the mechanism of linalool inhibiting Escherichia coli biofilm via c-di-GMP signaling pathway, Escherichia coli D5 as a object in this project, the effect of linalool on c-di-GMP, synzymes and degrading enzymes of c-di-GMP, extracellular polysaccharide, bacterial flagellum and fimbriae will be studied through fluorescent tags, liquid qualitative analysis, and molecular docking.

生物被膜是细菌黏附到生物或非生物载体表面，形成的一种高度组织化、系统化的微生物膜性聚合物。病原菌生物被膜的形成使细菌耐药性和逃避宿主防御系统能力增强，导致反复感染。本课题组从子宫内膜炎奶牛子宫黏液中分离出1株具有多重耐药性和强生物被膜形成能力的致病性大肠杆菌D5，发现香樟精油及其主要成分芳樟醇可显著抑制大肠杆菌生物被膜形成。环二鸟苷酸（c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的一类第二信使，可调控细菌鞭毛和纤毛的形成、胞外多糖的分泌，是调节细菌由浮游状态向生物膜状态转变的重要因子。本项目拟以大肠杆菌分离株D5为研究对象，通过荧光标记、液质分析、分子对接等技术，研究芳樟醇对生物被膜形成过程中c-di-GMP及其合成酶和降解酶表达的影响，分析芳樟醇对c-di-GMP介导的生物被膜胞外多糖、细菌鞭毛、纤毛等合成相关因子的调控作用，阐述芳樟醇通过c-di-GMP信号通路抑制大肠杆菌生物被膜的作用机制。

生物被膜的形成使细菌耐药性和逃避宿主防御系统能力增强，环二鸟苷（c-di-GMP）是调节细菌由浮游状态向生物被膜状态转变的重要因子。在前期分离出的强生物被膜形成能力的致病性大肠杆菌D5的基础上，通过荧光标记、分子对接、电镜、RT-RCR等技术，研究了芳樟醇对生物被膜形成过程中c-di-GMP及其合成酶和降解酶表达的影响，阐明了芳樟醇对c-di-GMP介导的生物被膜胞外多糖、细菌鞭毛、纤毛等合成相关因子的调控作用，明确了芳樟醇通过c-di-GMP信号通路抑制大肠杆菌生物被膜的分子机制，为中草药挥发性部位抗病原菌生物被膜新机制阐述和新型抗生物被膜制剂的研发提供依据。. （1）建立了微孔板为载体的大肠杆菌D5生物被膜模型，最佳培养条件为使用无盐LB培养基，pH值调至7.3，以2-4×10^7 CFU/mL细菌量接种，26℃培养48 h，该条件下生物被膜形成量OD600nm为2.296±0.0914；在此基础上分别建立了以奶牛子宫内膜上皮细胞和以奶牛子宫内膜组织为载体的大肠杆菌D5生物被膜模型，并建立了大鼠子宫生物被膜感染模型。. （2）芳樟醇在0.5-4 µL/mL范围内对大肠杆菌D5生物被膜的抑制作用呈剂量依赖性关系；芳樟醇的抑制作用与生物被膜生长周期密切相关，2 μL/mL芳樟醇对微孔板上细菌的最高抑制率为91.9%；而1 µL/mL芳樟醇对奶牛子宫内膜上皮细胞和奶牛子宫内膜组织上大肠杆菌的抑制率分别为99%和99.9%，25 µL/mL芳樟醇对其诱导的子宫内膜炎大鼠子宫载菌量的抑制率为95.23%。说明在体外，生命系统级别越高芳樟醇的抑菌作用越强，但在机体保护下，体内组织对病原、药物的抵抗力增强，感染机体的病原菌接种量升高，药物的有效浓度亦升高。. （3）芳樟醇抑制flhC、flhD的表达，降低c-di-GMP合成酶ydaM、yegE的表达，减少胞内c-di-GMP含量，促进鞭毛相关基因ycgR、fliG、fliM的表达，减少纤毛合成基因csgA、csgD及动力基因motA的表达，破坏细菌纤毛的形成和鞭毛的运动，抑制细菌黏附；同时芳樟醇抑制rpoS、csrA的表达，降低c-di-GMP合成酶dgcT、ydeH表达，减少胞内c-di-GMP含量，抑制胞外多糖基因pgaA、pgaB、bcsA的表达，减少其分泌，从而抑制细胞生物被膜的形成。