PD-1/PD-L2通路在肝毛细线虫感染所致肝脏肉芽肿的免疫负调控作用及其机制研究

Hepatic capillariasis is a serious neglected food-borne parasitic zoonosis caused by the tissue-dwelling nematode capillaria hepatica. After the ingestion of embryonated eggs, larvae hatch in the intestine and enter the liver via the portal vein system, which can cause hepatic granuloma formation, liver fibrosis or even death. In our previous studies, we have found the increased programmed death-1 (PD-1) expression in CD4+ T cells of patients suffering from capillaria hepatica infection and elevated programmed death ligand-2 (PD-L2) expression in patients’ liver tissues. Furthermore, there is negative correlation between hepatic granuloma size, liver function and PD-L2 expression level. However, it is not yet clear whether PD-1/PD-L2 pathway is involve in the negative regulation of liver granuloma formation in chronic hepatic capillariasis. In this study, we would provide evidences that PD-1/PD-L2 pathway play a crucial role in regulating the formation of hepatic granuloma in rodent models and cell models, and would try to illustrate the possible mechanisms of PD-1/PD-L2 pathway regulation in capillaria hepatica infection. We believe that this research would provide a new potential mechanism of immunomodulation in helminth infection to avoid excessive immunopathogenesis.

肝毛细线虫病是一种被严重忽视的食源性寄生虫病。感染期虫卵通过误食在消化道内发育后移行寄生于肝脏，导致虫卵肉芽肿形成、肝脏纤维化甚至死亡。前期工作证实肝毛细线虫感染患者血CD4+T细胞上程序性死亡-1（Programmed Death-1, PD-1）表达明显升高；虫卵在肝脏沉积可以引起炎性细胞表面程序性死亡配体-2（Programmed Death Ligand-2,PD-L2）的表达显著上升，其升高水平与肉芽肿范围及肝功能呈明显负相关，其中机制尚不明确。本研究拟用动物模型和细胞模型；明确PD-1/PD-L2通路参与引起肝脏肉芽肿形成中的作用；研究阻断PD-1/PD-L2通路后对肝毛细线虫感染后对肝脏肉芽肿的影响；以巨噬细胞为切入点，阐明PD-1/PD-L2通路调节肝脏肉芽肿形成机制。本研究为完善PD-1/PD-L2通路在蠕虫免疫调节作用中的分子机制，并进而影响抗感染免疫应答提供理论依据。

肝毛细线虫病是严重被忽视的人兽共患寄生虫病，能导致宿主肝脏损伤、肝功能严重紊乱、肝脏纤维化甚至死亡。本项目首先建立肝毛细线虫感染模型，免疫学分析表明肝毛细线虫感染后引发小鼠模型早期以Th1类免疫应答，进展期及慢性期以Th1/Th2混合免疫应答，且随着感染时间的延长，肝毛细线虫感染可以对肝脏在功能上和结构上造成损害，可以诱导肝脏出现纤维化表现。PD-1通路分析表明，肝毛线线虫感染后PD-1通路两个配体在不同感染时期呈现以不同的主要配体表达，其中在感染进展期及慢性期主要以PD-L2表达为主。脾细胞的细胞因子分析表明，在感染早期以IFN-γ及IL-2升高为主，但在慢性期IL-4及IL-10的表达明显升高。此外，肝毛细线虫感染后，肝脏巨噬细胞在不同时期分化为不同亚型，且随感染时间延长诱导M2亚型巨噬细胞大量表达。由于M2型巨噬细胞可以降低机体免疫应答水平，在感染过程中也起到免疫调节性作用，这样的应答特征促使了肝毛细线虫在体内可以长期寄生。.在体外实验中，先使用肝毛细线虫可溶性虫卵抗原（SEA）与巨噬细胞共培养，肝毛细线虫SEA在体外能诱导PD-L2表达明显上升，刺激巨噬细胞向M2亚型分化，刺激巨噬细胞分泌炎性及抗炎细胞因子。在使用PD-L2单克隆抗体体外阻断实验可以显著降低巨噬细胞PD-L2表达水平，降低M2细胞比例，导致炎性细胞因子IFN-γ及IL-2仅轻度升高，而抑炎细胞因子IL-4及IL-10未见明显升高，提示PD-L2单抗封闭能够改变肝毛细线虫诱导的变异应答，减弱免疫反应。.PD-L2单抗体内阻断实验表明，肝毛细线虫感染后可以促使肝脏炎症反应加剧、肝脏肉芽肿形变恶化及肝脏纤维化程度加重。此外，PD-L2阻断可以诱导巨噬细胞中炎性细胞（M1）的比例，提高了感染小鼠的炎症应答水平。体外培养巨噬细胞的细胞因子及体内肝脏巨噬细胞分泌细胞因子表明炎性细胞因子IFN-γ及IL-2显著升高，而抗炎因子IL-4及IL-10的表达显著下降。.由上述肝毛细线虫感染模型的研究发现，肝毛细线虫感染后通过调控PD-1/PD-L2通路，改变巨噬细胞M1及M2亚型比例，调控细胞因子的表达，从而调控机体的免疫应答，进而影响肝脏功能及虫卵肉芽肿的形成和进展。