作物基因沉默途径中siRNA的加工机制研究

Gene silencing/ RNAi is an important regualtion pathway and invloved in plant development such as ta-siRNA generation, methylation of transposon, and epigentics. RNAi technology is widely used to molecular breeding such as anti-virus, pest-resist, trait improvement and fertility. The question that people have to face is how to choose the target sequences, how long should be used,and which region is suitable to silencing.Especially used in gene engineering, we not only consider the efficiency of silencing, but also "off-target" of silencing. However, untill now we do not know which siRNA is selected into RISC and how the hairpin RNA is processed in transgenic plants. In this study, we focus the questiones mentioned above. We construct a series of hairpin RNA vectors with different promoters, different introns, different directions and different fragments, then tranform them into model plants rice and Arabidopsis. The siRNA generated in transgenic plants will be identified using deep-sequencing, demonstrating the mechanism of siRNA processing from hairpin RNA. We aim to elucidate how hairpin RNAs are processed by DCL in transgenic plant and the regular pattern of siRNA access into RISC. It is very important not only for appalication, but also silencing theory.

基因沉默/RNAi是植物体内重要的基因调控机制，广泛参与了植物体内的发育调控，如ta-siRNA，转座子甲基化，表观遗传学等过程。基因沉默技术在分子育种中也得到了广泛应用，如抗逆、品质改良、育性等。人们在应用基因沉默技术时经常要面临的一个问题就是如何选择目的序列，选定那个区段比较合适，长度多少合适等难题，尤其是在基因工程中既要考虑沉默的有效性又要考虑"脱靶"的问题，但对外源发卡RNA加工及那一条siRNA选择进入RISC人们仍不清楚，因此本研究针对上述问题开展研究，构建一系列的发卡RNA载体，采用不同的启动子，不同的内含子，不同长短的目标序列以及不同的插入方向，转化模式植物水稻和拟南芥，利用高通量测序技术对其产生的siRNA进行分析，研究siRNA在作物体内的加工规律，阐明DCL对外源发卡RNA的加工方式和siRNA进入RISC的规律，并结合amiRNA进行验证。具有重要的应用和理论价值。

基因沉默/RNAi是植物体内重要的基因调控机制，广泛参与了植物体内的发育调控，如ta-siRNA，转座子甲基化，表观遗传学等过程。基因沉默技术在分子育种中也得到了广泛应用，如抗逆、品质改良、育性等。为了阐明发卡RNA产生siRNA的规律，我们构建一系列的发卡RNA载体，采用不同的启动子，不同的内含子，不同长短的目标序列以及不同的插入方向，转化模式植物水稻和拟南芥，利用高通量测序技术对其产生的siRNA进行分析，研究siRNA在作物体内的加工规律，并进一步对基因沉默的功能基因进行深入的功能研究。通过项目的执行，我们发现siRNA可在发卡结构颈部的任何部位产生，但在不同的部位产生的siRNA数量有显著差异，存在明显的热点区，产生的siRNA大小以21-24nt为主，其中21nt最多，启动子，内含子、插入方向等对siRNA的产生没有显著影响，序列越长产生的有效的siRNA越多，但来源于不同基因的序列所产生的siRNA数量有显著性差异；统计分析表明发卡RNA所产生的20-22nt的siRNA对第一个碱基有明显的偏好性，超过50%的siRNA第一个碱基是T。为分析siRNA沉默效率及其对基因功能的影响，我们对其中的一个基因OsCOLE1进行了深入的分析，结果表明siRNA可以有效的沉默该基因，OsCOLE1的沉默直接影响水稻中细胞内生长素的运输，引起水稻矮化；为了进一步分析RNA沉默途径上的重要基因RDRP（依赖于RNA的RNA聚合酶）与siRNA产生之间的关系，我们对其启动子进行了研究，结果表明RDRP能够在拟南芥的根、茎、叶、花等多个组织中表达，启动子中存在多个激素应答原件；通过对拟南芥和玉米miR169家族及其前体的研究，发现ath-miR169d与zma-miR169a前体具有相似的二级结构，产生的小RNA数量多，结构简单，适合作为amiRNA的骨架，能够有效的沉默目的基因。