SUMO-1基因在肝癌侵袭与转移中的作用及机制研究

Growing evidence shows that SUMO-1 plays a critical role in development of malignant tumor. By means of RT-PCR and western blot we found that SUMO-1 was upregulated in both hepatocellular carcinoma(HCC) specimens and HCC cell lines. Wound healing and Traswell assays revealed that the migration capacity of HCCLM3 was slowed down by transfection of SUMO-1 shRNA.Thus, the results suggest that SUMO-1 is involved in regulation of invasion and metastasis of HCC. Therefore, we will entail RT-PCR, Western blot and Immunohistochemistry to evaluate the relationship between the expression levels of SUMO-1 and clinicopathological grades, and determine the effects of SUMO-1 expression on the response to treatment and on prognosis In addition, SUMO-1 shRNA will be transfected into high metastatic cell lines of HCC and the inhibitory effects of SUMO-1 shRNA on cell migration and metastasis will then be examined in vitro and in vivo. Changes of genes expression in signaling pathways related to invasion and metastasis of HCC will be detected by RT-PCR, western blot. In order to further elucidate the relationship between SUMO-1 gene and HCC invasion and metastasis, proteomic approaches will be applied to identify new proteins regulated by SUMO-1. These findings will help to clarify whether the SUMO-1 gene could serve as a biomarker and target for diagnosis and treatment of HCC.

研究表明SUMO-1基因和恶性肿瘤发生发展关系密切。我们前期研究发现在肝癌标本及肝癌细胞中，SUMO-1基因均显著高表达。通过RNAi方法，抑制HCCLM3中 SUMO-1基因表达，划痕实验、Transwell侵袭实验显示细胞迁移及侵袭能力下降，表明SUMO-1基因和肝癌的侵袭与转移有关。本项目拟通过RT-PCR、western blot及免疫组化进一步研究SUMO-1基因和肝癌病程、病理、疗效等临床病理参数的关系；采用RNAi方法稳定抑制肝癌高转移细胞株中SUMO-1基因的表达，通过体外、体内实验来研究对肝癌侵袭与转移的影响，通过RT-PCR、western blot来研究SUMO-1基因表达抑制后与肝癌侵袭与转移相关基因、信号通路的变化；通过蛋白组学方法来发现新的SUMO-1基因调控蛋白，进一步阐明SUMO-1基因和肝癌侵袭与转移的关系。为以SUMO-1基因为靶点诊治肝癌提供实验依据。

SUMO修饰在癌症的发生发展中具有重要的作用，本项目的研究出发点是以SUMO修饰为靶点，研究抑制SUMO修饰对肝癌侵袭与转移的影响，为以SUMO修饰为靶点治疗肝癌提供实验依据。但由于研究发现抑制SUMO-1基因表达后出现SUMO-2基因表达水平的增高，可以替代SUMO-1基因的部分功能，因此为研究SUMO修饰在肝癌侵袭与转移中的作用，后续研究以SUMO修饰家族中的唯一的E2连接酶UBC9为靶点进行实验，E2连接酶UBC9表达抑制将导致肝癌细胞SUMO修饰功能的抑制。研究获得如下的研究结果：.1、通过检测100位肝癌患者的标本，对比检测肝癌及癌旁组织，通过免疫组化及western blot实验发现，UBC9基因在肝癌中的表达水平明显高于癌旁肝组织，并且UBC9基因的表达水平与临床预后密切相关；.2、将UBC9 shRNA转染肝癌细胞HepG2和MHCC97h抑制UBC9基因的表达，CCK-8实验检测证实可抑制肝癌细胞增殖。下调UBC9基因的表达，肝癌细胞凋亡水平增加，而且主要是通过减少凋亡抑制因子Bcl-2的水平来实现的。NF-κB信号通路关键蛋白P65水平下调，这进一步说明下调UBC9促进肝癌细胞的凋亡是通过NF-κB信号通路来实现的。.3、研究下调UBC9后对肝癌细胞侵袭与迁移的影响。研究发现下调UBC9基因的表达后，划痕与transwell实验显示肝癌细胞的侵袭与迁移能力下降。同时我们检测到β-catenin、TCF-4、MMP2蛋白表达量均下调，即经典Wnt通路受到抑制，由此可以说明UBC9基因可能通过激活肝癌细胞中的 Wnt/β-catenin/TCF-4通路，进而激活下游的靶基因MMP-2，促进肝癌细胞的侵袭与迁移能力。.4、UBC9基因表达下调后，肝癌细胞对阿霉素的敏感性增加，细胞凋亡增加，并且是通过增加凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved-caspase3/Caspase3的表达来实现的。同时检测下游相关通路蛋白发现，p-ERK及p-P38表达减少，说明下调UBC9增加肝癌对阿霉素的敏感性是通过ERK/MAPK及p-p38/MAPK细胞信号通路来实现的。