半滑舌鳎IgT在皮肤粘膜中的抗菌作用和机制研究

Half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis) is one of the endemic flatfish in China. However, cultured half-smooth tongue sole has been severely threatened by the skin ulceration disease, which became the main trouble in aquaculture. Skin is the main mucosal surface and the first immune barrier, so it is an effective strategy to find key genes for disease resistance from the skin. IgT is a new and special Ig isotype in teleost, however, the research limited in movable teleost and their intestinal mucosal immunity. Based on firstly decoding the gene sequences of IgT and pIgR, we will conduct the systematic research on the underlying list: 1) Identification of the characteristics of IgT in protein structure, the transport motif of IgT from skin to mucosa, and the expression profiles under normal and bacterial infected conditions. 2) Exploration the function of IgT on killing of antigen, and activating of anti-pathogen pathway both in animal and cell models, which will be constructed by genome edit and RNAi. Our project will explain the important function and signal pathway of IgT in the skin mucosal immunity of benthic fish (half-smooth tongue sole), and provide theoretical basis and technical supports for skin ulceration disease prevention, resistance breeding, and vaccine development in aquaculture.

半滑舌鳎是我国特有的海水养殖珍贵品种。近年来皮肤溃疡病频繁暴发，成为限制产业发展的首要问题。皮肤粘膜组织是阻止病原进入体内的第一道防线，从皮肤中寻找抗病关键基因是一种非常有效的策略。IgT是一种新型的、硬骨鱼类特有的免疫球蛋白。目前对IgT的研究仅限于游动性鱼类，且局限于肠粘膜免疫。本项目拟在率先破译半滑舌鳎IgT和pIgR基因的基础上，开展以下研究：1）解析半滑舌鳎皮肤粘膜中IgT的蛋白结构、转运模式和表达特性，明确IgT+淋巴细胞的发育过程及在皮肤中的定位和活化特征；2）利用基因组编辑和RNA干扰等技术构建个体模型和细胞模型，检测皮肤粘膜IgT的抗菌作用及抗菌相关基因的表达模式，分析IgT对补体信号通路等抗病相关信号通路的调控作用。本项目的研究成果将阐明半滑舌鳎IgT在皮肤粘膜中的免疫功能和信号调控通路，能够为鱼类皮肤疾病的防控、抗病品系的选育和疫苗的研发提供新的实验依据。

IgT是一种新型的、硬骨鱼类特有的免疫球蛋白，在黏膜免疫防御中发挥重要作用。本项目从以下四个方面对半滑舌鳎IgT（csIgT）进行了系统的研究：（1）半滑舌鳎IgT表达模式和IgT+淋巴细胞在黏膜免疫中的作用研究。破译了半滑舌鳎IgT基因膜结合型和分泌型序列，解析了半滑舌鳎sIgT和mIgT的蛋白结构、转运模式和表达特征。进行csIgT蛋白表达和制备多克隆抗体，获得抗csIgT的多抗。利用免疫荧光实验，在半滑舌鳎皮肤、鳃、肠和头肾中进行了IgT+淋巴细胞的发育过程及在皮肤中的定位和活化特征；（2）建立了一种半滑舌鳎皮肤黏液RNA的提取方法，在半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病的抗病家系和易感家系组织、黏液中进行IgT含量的比较分析，发现IgT在抗病家系鳃、脾、肠和黏液中的表达量显著高于易感家系。进一步在蛋白水平进行检测，通过牛津杯实验，证明半滑舌鳎IgT重链蛋白对哈维氏弧菌、副溶血弧菌有抑菌活性，从而确定皮肤黏膜IgT的抗菌作用；（3）转基因/基因敲除斑马鱼的构建和IgT功能研究。构建携带csIgT的Tol2质粒，利用显微注射技术注射斑马鱼受精卵，构建了转csIgT的斑马鱼模型。筛选F0代与野生型交配，获得F1代。在显微镜下观察到F1代斑马鱼呈现全身绿色荧光，确定csIgT的稳定表达。建立哈维氏弧菌感染斑马鱼模型，在细菌感染后检测IgZ、IgM和IgD的表达趋势，发现3种免疫球蛋白对细菌感染有明显的响应，在内脏团种的表达量有显著升高；（4）半滑舌鳎IgM和IgD基因克隆和表达模式研究。对半滑舌鳎IgM和IgD进行克隆鉴定，发现IgT、IgM和IgD在免疫组织中的表达模式存在差异，IgM和IgD在脾脏、肾脏等系统性免疫组织中表达量较高，IgT在黏膜免疫相关组织表达量最高。对IgM和IgD在细菌感染后的表达模式进行检测，发现哈维氏弧菌感染后免疫组织中IgM和IgD的表达量显著升高，从而确定IgM和IgD参与了半滑舌鳎抗细菌病的免疫防御过程。本项目的研究成果阐明半滑舌鳎IgT、IgM和IgD的免疫功能，为鱼类皮肤疾病的防控、抗病品系的选育和疫苗的研发提供新的实验依据。