半滑舌鳎早期骨骼发生、发育及其调控机制

Ontogenetic morphological characteristics of fish change dramatically at early life stages. Moreover, growth and development of skeleton is important in the ontogenetic process. Consequently, clarifying the skeletal development characteristics and their regulation mechanisms at early life stages are of theoretical significance and practical value for explanation of the fish functional trends and environmental adaptation. The vertebrate bone formation is regulated by bone morphogenetic proteins (BMP), among which BMP2 and BMP4 exhibit the highest osteoinductive activities. Investigating the genetic characteristics and function of these factors may help understanding the skeletal development at the molecular level. The Tongue sole (Cynoglossus semilaevis) is regarded as a perfect target species for sea farming and sea ranching. To date, the regulatory mechanisms of skeletal development in C. semilaevis has thus far only rarely been reported. In this study, on the basis of the systematic observation of skeletal development characteristics of C. semilaevis, genomic structure and mRNA expression (temporal and spatial expression pattern) analysis of the BMP genes (BMP2 and BMP4) will be performed in order to examine the association between the BMP genes and early skeletal development at both the morphologic and molecular levels. The results may help investigating the regulatory mechanism of skeletal development in C. semilaevis, and lay a theoretic foundation for research on the fish early developmental biology and optimization of the fish seedling production technology.

鱼类早期发育阶段个体发育形态特征变化剧烈，骨骼生长发育是个体发育的重要环节，研究鱼类早期骨骼发生、发育特征及其调控机制，对揭示鱼类早期发育阶段的功能趋向及环境适应具有重要理论意义和实践价值。脊椎动物骨骼形成多受骨形态发生蛋白(BMP)调控，其中BMP2、BMP4又是诱导成骨活性最强的因子，研究它们的遗传学特征及功能是从分子水平认识骨骼生长发育的基础。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要海水增养殖对象，目前国内外有关其骨骼发生、发育调节机制研究尚属空白。本项申请拟在系统观察半滑舌鳎早期骨骼发生、发育特征基础上，研究BMP2和BMP4的基因结构特征和时空表达模式，从形态和分子两个水平探讨BMP相关基因与早期发育阶段骨骼发生、发育的相关性，探讨半滑舌鳎早期骨骼发生、发育的调控机制，丰富硬骨鱼类早期发育生物学研究，为优化与创新养殖鱼类苗种生产技术提供理论依据。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要海水增养殖对象，目前国内外有关其骨骼发生、发育调节机制研究十分有限。本项研究在形态水平方面，采用硬骨-软骨双染色技术对半滑舌鳎仔稚鱼整体骨骼进行染色，系统研究了头部骨骼、脊柱、冠状幼鳍、胸鳍和腹鳍等的发育过程。研究结果表明：半滑舌鳎骨骼发育过程中的形态特征变化（临时骨骼结构的出现、退化和消失；右眼迁移的变态过程；软骨骨化；鳍的发生发育）对于其早期巡游模式、摄食模式等生态习性具有重要意义。在分子水平方面，首先筛选了EF1A和18S作为实时荧光定量PCR的内参基因，分别应用于后续基因组织表达分布和不同发育阶段mRNA表达水平的检测；以骨形态发生蛋白(BMP)家族关键调控因子(BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和Dorsalin-1-like)及骨骼发育相关转录因子(Runx2 和Osterix)作为研究对象，开展了基因的克隆和结构特征分析；根据已获得的基因序列信息，采用实时荧光定量PCR和整体原位杂交等技术，检测各基因的时空表达模式。组织表达分布结果表明，BMP2和BMP7基因在软骨、背鳍等骨组织中较高的表达水平揭示了其在骨骼发育中的重要作用；BMP6、Dorsalin-1-like分别在性腺、心中表达量最高，表明其功能倾向于调节生殖系统及心脏的发育；BMP4、Runx2和Osterix具有较为广泛的组织分布，其与骨骼发育的相关性不明确。此外，各基因在早期发育阶段的时空表达模式结果显示，除BMP7之外的其余6个基因在胚胎发育阶段均存在一个具有极高表达水平的时期，标志着这些基因在孵化前已起始对生长发育的调节作用；作为骨骼发育的潜在调控基因，BMP2、BMP4、BMP6和BMP7 mRNA在半滑舌鳎仔稚鱼的发育过程中具有相似的空间分布特征，即各基因在早期仔鱼中的表达集中于头部和躯干前部，随后在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍中的mRNA表达量增加，揭示了四个基因在鳍发育中的潜在调控作用。最后，通过对BMP2、BMP6和BMP7基因5′上游调控区进行分段和双荧光素酶活性检测，揭示了可能参与上述基因表达调控的启动子区段，为进一步分析BMP基因上游调控元件提供线索。上述研究结果不仅丰富了鲆鲽类早期发育生物学的研究，更为揭示海水硬骨鱼类早期骨骼发生、发育的调控机制研究奠定了重要基础。