小鼠睾丸特异基因Ubiquilin3在精子发生及男性不育中功能的研究

Ubiquilin3基因是我们筛选出的睾丸组织特异表达基因，与爪蟾的XDRP1基因高度同源，XDRP1通过与cyclinA1相互作用阻断细胞周期进程。前期研究表明该基因主要表达在精子发生的VIII～XII阶段和精子细胞形成的1～14时期，因此推测该基因在精子发生和成熟过程中是否通过与cyclinA相互作用而发挥重要调节作用。本课题拟建立Ubiquilin3-/-小鼠模型；应用分子生物学与分子生殖学实验手段分析Ubiquilin3-/-小鼠生殖功能、睾丸形态和细胞学变化；利用酵母双杂交体系寻找与其相互作用的靶蛋白，研究CyclinA1是否与Ubiquilin3相互作用，并确认其相互作用位点；结合临床男性原因不明不育患者精子Ubiquilin3基因表达及基因结构异常特征分析，揭示Ubiquilin3在精子生成与成熟及男性不育中的功能作用和相关机制，为临床男性不育的诊疗和生殖健康提供科学指导。

按照项目研究目标和研究内容，建立了Ubiquilin3-/-小鼠模型，并对Ubiquilin3-/-小鼠生殖功能、睾丸形态学以及细胞学进行分析，以及Ubiquilin3基因在12种小鼠组织、16种人组织、不同发育周龄小鼠睾丸组织以及10种生精细胞和sertoli细胞中的表达等进行研究，相关研究论文已发表3篇。在对Ubiquilin3-/-雄性小鼠生殖功能进行分析时，发现与Ubiquilin-WT小鼠相比较，Ubiquilin3-/-雄性小鼠生殖功能各项指标没有明显改变。说明Ubiquilin 基因敲除没有引起小鼠生殖功能的改变，Ubiquilin 基因是小鼠睾丸特异基因，但并非生殖功能的关键基因。因此我们改变了原有的实验方案。我们检测了Ubiquilin3-/-雄性小鼠的miRNA，即miR124及miR145，发现miRNA的表达有其特异性，因而首先在卵巢癌细胞系中对miR124和miR145及其靶作用基因GMFβ的相互关系进行深入研究。运用生物信息学预测了miR124和miR145与GMFβ基因的靶作用关系，通过双荧光素酶实验检测两者的相关性；转入miR-124和miR145表达载体，观察GMFβ 的mRNA及蛋白水平变化；CCK-8及流式细胞学方法检测miR-124、miR145过表达细胞系中细胞凋亡和增殖情况；Transwell细胞迁移和侵袭实验分析miR-124和miR145对细胞迁移和侵袭方面的影响；同时对临床11例侵润型卵巢癌组织做了miR145与GMFβ关系分析。证实了在侵袭性卵巢癌细胞及侵润型卵巢癌组织中，miR-145靶作用GMFβ 3'UTR，转录后水平下调其蛋白表达；miR-145通过靶作用GMFβ下调其表达而降低卵巢癌细胞的侵袭和转移功能。相关研究论文正在投稿中。另外，我们延续了原有的研究方向，对AURKB与MAPK参与调控小鼠受精卵早期发育的机理进行了深入研究；运用共聚焦显微镜开展了Aurora激酶A、B在小鼠受精卵第一次有丝分裂进程中的表达与定位的研究；针对Aurora激酶A调节小鼠受精卵早期发育的机制开展了系统研究。已发表相关研究论文4篇。由于多种因素我们改变了原有实验方案，但是圆满完成了课题的各项要求。