睾丸特异miRNA-741-5p与睾丸倾向miRNA-741-3p在小鼠精子发生中的功能研究

The transcription and translation of a large number of genes are temporally and spatially separated during the meiotic and post-meiotic stages of mammalian spermatogenesis. The increasing evidence indicates that microRNA may play an essential role in this process. In order to investigate the function and molecular mechanism of mouse testis-specific miRNA-741-5p and testis-prefer miRNA-741-3p in the spermatogenesis, the target genes of miRNA-741-5p and/or miRNA-741-3p will be identified and annotated; the correlation between miR-741-5p/3p and their target genes expression pattern at the different developmental stages of spermatogenic cells will be further analyzed; the effects of related reproductive hormones and cell growth factors on miR-741-5p/3p expression and variety of their target genes expression will be illustrated in the male germ cells; and finally miR-741-5p/3p-mediated gene regulatory networks and signaling pathways during spermatogenesis will be systematically explored. The findings will not only provide theoretical basis for understanding the complex regulation mechanism of spermatogenesis, but also provide a novel idea for applying miRNA to animal breeding and even human reproductive medicine as molecular targets.

在哺乳动物精子发生过程中，大量基因的转录和翻译在减数分裂期与精子形成期发生着时空分离，研究发现microRNA可能在其中发挥着关键的调控作用。为探索小鼠睾丸特异表达miRNA-741-5p与睾丸倾向表达miRNA-741-3p在精子发生中的功能与分子机制，本项目将识别与注释miRNA-741-5p与miRNA-741-3p调控的靶基因与作用机制，分析二者及其靶基因在生精细胞不同发育阶段的表达规律与相关性，阐明相关生殖激素与细胞生长因子对生精细胞miRNA-741-5p与miRNA-741-3p的表达影响及其靶基因的表达变化，从而系统了解二者在精子发生中所参与的基因调控网络与信号通路。研究结果将为解析精子发生过程中复杂的分子调控机理提供理论基础，并可为将microRNA作为分子靶标应用于动物繁育乃至人类生殖医学探索新的思路。

理解miRNA 在精子发生中所发挥的功能与分子机制，是全面揭示哺乳动物精子发生分子调控机理的关键步骤。本项目针对来自于同一miRNA 前体两臂端的miR-741-5p 与miR-741-3p 的功能与机制进行深入探讨。..研究发现miR-741-5p 与miR-741-3p均在小鼠睾丸组织中高度表达，属于睾丸倾向表达miRNA。利用生物信息学，对二者调控的靶基因系统分析，筛选了对精子发生有重要功能的候选靶基因。对miR-741-5p的8个候选靶基因与miR-741-3p的10个候选靶基因进行表达质粒构建与细胞水平的体外验证。结果表明TDRKH是miR-741-5p调控的靶基因，调控元件位于蛋白编码区，物种间保守。VEGFA是miR-741-3p调控的靶基因，调控元件位于3’-UTR，物种间保守。通过进一步构建TDRKH和VEGFA的调控元件突变质粒，以及细胞水平的体外验证，进一步佐证上述结论。..通过分析miR-741-5p 与miR-741-3p对细胞内源的TDRKH与VEGFA表达调控，miR-741-5p对TDRKH mRNA水平没有显著影响，但可以显著降低TDRKH的蛋白水平。miR-741-3p可以同时显著降低VEGFA的mRNA与蛋白水平。结果表明，miR-741-5p通过翻译抑制对靶基因TDRKH进行调控，而miR-741-3p通过mRNA降解对靶基因VEGFA进行调控。..对miR-741-5p与miR-741-3p在小鼠睾丸中定位发现，miR-741-5p主要表达于精原干细胞，精母细胞，圆形精子细胞，但不在长形精子细胞中表达。miR-741-3p主要表达于精原干细胞，精母细胞，圆形精子细胞，低表达于长形精子细胞，不表达于成熟精子细胞。通过结合本结果与其它文献报道表明miR-741-5p与miR-741-3p的定位与其靶基因TDRKH与VEGFA的表达定位存在着一定的相关关系。通过体外培养小鼠生精细胞，添加IGF-1、BMP15、E2、Vc，未发现miR-741-5p与miR-741-3p的表达水平发生显著变化。..本研究结果系统了解了miR-741-5p与miR-741-3p在精子发生过程中的调控基因及其功能异同，为解析精子发生复杂的分子机理提供理论基础。截至目前，在本项目的资助下，发表SCI研究论文2篇，协助培养博士1名，硕士1名。