细胞型朊蛋白PrPC与浮舰蛋白flotillins相互作用对卵巢细胞信号转导的影响

疯牛病等海绵状脑病是由细胞型朊蛋白（PrPC）构象转变形成的朊病毒（PrPSc）导致的。PrPC调控卵泡发育和受精卵形成,参与信号转导等细胞事件。浮舰蛋白（flotillins）形成的脂筏不仅是PrPC转变成PrPSc的场所，而且为PrPC发挥生理功能提供了平台。研究PrPC与flotillins相互作用对卵巢细胞信号转导的影响对明晰PrPC在卵巢细胞内的作用具有重要意义，目前还未见此类报道。本项目通过基因组表达谱芯片和实时定量PCR技术分析PrPC与flotillins在中国仓鼠卵巢细胞内相互作用引发的信号转导通路，并采取酵母双杂交、免疫共沉淀和GST-Pulldown方法进一步确定PrPC与flotillins发生相互作用的分子区域。上述研究旨在探索PrPC影响卵巢细胞功能的分子机制，为筛选阻断PrPC转变成PrPSc但是不影响PrPC生理功能的相关靶分子化合物提供理论依据。

细胞型朊蛋白（PrPC）在卵巢和输卵管内表达，与卵泡发育和受精卵形成有关。浮舰蛋白（flotillins）形成的脂筏为PrPC发挥生理功能提供了平台。本项目旨在研究PrPC与flotillins是否发生相互作用、发生相互作用的分子区域及对卵巢细胞信号转导的影响，这对明晰PrPC在卵巢细胞内的作用具有重要意义。..通过构建基因缺失突变体和采用GAL4酵母双杂交法确定了PrPc与flotillins的相互作用关系及其分子作用区域。结果表明：成熟朊蛋白PrP25-241与Flotillin-1有强相互作用，两者发生相互作用的分子区域位于 Flotillin-1蛋白在进化上高度保守的磷酸化位点151-161区段。PrP102-241不与 Flotillin-1发生相互作用，这意味着与Flotillin-1发生相互作用的PrP的分子区域位于25-102的近氨基端位子。PrP25-241与Flotillin-2有弱的相互作用，PrP102-241不与 Flotillin-2发生相互作用。 ...构建了PrP和flotillins的系列真核重组表达载体，检测了其在中国仓鼠卵巢细胞CHO中的瞬时表达情况，进行了PrPc与flotillin-1和flotillin-2的共转染。免疫印迹确定了PrP和flotillins基因能够被pCMV-HA和pCDNA3.1/Myc-His(-)B载体在CHO细胞中表达。Flotillin-2在CHO表达时除了出现与预计分子量大小相一致的48Ku目的蛋白带外，还有一个35ku的条带。基因序列分析发现在第430-438位核苷酸存在一个似Kozak序列（CGC ATG GGC）。将ATG突变成GCT（丙氨酸）后检测表明35ku小蛋白始终存在。这表明该蛋白不是由于重新起始翻译导致的，而是翻译后的裂解产物。..通过上述工作，初步确定了PrPc和Flotillins的相互作用关系，明确了PrPc与 Flotillin-1的相互作用位点是位于Flotillin-1蛋白在进化上高度保守的磷酸化位点151-161区段，实现了PrPc和Flotillins在CHO细胞内的表达，为分析PrPc和flotillins相互作用在CHO细胞内触发的信号转导通路奠定了基础。本项目培养硕士研究生4名，毕业2名。发表文章9篇，其中SCI文章3篇。