三株昆虫共生菌免疫抑制先导化合物的发现及作用机理研究

Immunosuppressants have been widely used for anti-rejection response in organ transplantation and the treatment of autoimmune diseases. The existing immunosuppressants exhibit narrow therapeutic window, expensive cost, significant toxic effects, and other disadvantages. On the other hand, the demand of new immunosuppressive drugs with high efficacy and low toxicity is more and more urgent because of the rapidly increasing market. In order to search for immunosuppressive lead compounds, we have obtained three insect symbiotic microbes for further studies. These microbes, showing higher immunosuppressive bioactivity, were screened by the model of T lymphocytes transformation experiment. However, we do not clearly know the definite bioactive substances, structure-activity relationship, selectivity and mechanism. Firstly, we plan to isolate the new active secondary metabolites with the follow-up fractionation procedure co-guided by LC-MS/MS rapid dereplication and immunosuppressive activity bioassay. Secondly, The structures of the active compounds will be elucidated by many kinds of modern means of natural products research and spectroscopic methods. And the bioactivity will be comprehensive evaluatied by other screening models. Finally, we will select the monomer with stronger bioactivity, less toxicity and distinct mode of action to study the mechanism. This research will give some lead compounds, related theories, and experimental bases for the development of new immunosuppressive drugs. The study aims to reveal the excellence in the biosynthetic potential of the insect symbiotic microbes. It will provide powerful evidence that the insect symbiotic microbes might become important resources for new active natural products.

免疫抑制剂广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，现有的免疫抑制剂多存在治疗范围小、价格昂贵、毒副作用多等缺点，快速增长的药物市场也迫切需要更多高效、低毒的新型免疫抑制剂的出现。本项目立足于丰富的昆虫共生菌资源，采用T淋巴细胞增殖实验模型，前期筛选获得了三株显示较强免疫抑制活性的昆虫共生菌，但活性物质基础、结构与强度的关系、选择性及作用机制还不明确。计划采用现代分离纯化技术，结合LC-MS/MS快速排重和免疫抑制活性导向追踪手段，高效快速分离结构新颖、活性显著的次生代谢产物；运用多种现代波谱学技术进行结构解析，并对单体化合物进行免疫抑制活性的综合评价；对活性强、毒性小、作用方式独特的单体化合物进行作用机理的初步研究，为研制新型免疫抑制药物提供先导化合物及相关理论和实验依据。该研究有望揭示昆虫共生菌卓越的生物合成潜力，为其成为寻找新活性天然产物的重要资源提供有力的证据。

在三年的项目执行过程中，项目组成员围绕课题内容及目标开展工作，基本完成了预定的任务。搭建了微生物的实验平台，完成了八种昆虫共生菌分离纯化工作。以筛选出的四株活性菌株作为研究对象，开展了其发酵物中次生代谢产物的分离纯化及功能研究。利用多种现代分离手段进行了系统的化学成分研究，共分离得到43个单体化合物，鉴定了其中39个化合物的结构，包括1个具有新颖骨架的代谢产物，3个首次发现的新结构化合物。分离得到的化合物结构类型多样，包括生物碱类、香豆素类、萜类、大环内酯类及环肽类等化合物。根据结构的特点，我们对单体化合物进行了体外免疫抑制、细胞毒、酶抑制活性的综合评价，发现了一系列具有较好活性的内生菌代谢产物。免疫抑制活性测试结果显示，10个化合物具有中等的免疫抑制活性，初步的机理研究发现，化合物10对于ConA诱导的细胞因子IL-2、IL-4、IL-5的产生均有一定的抑制作用。体外细胞毒活性实验结果发现，23个化合物具有不同程度的细胞毒活性，其IC50值在3.63-52.59 μM之间；其中化合物6、8和22对HepG-2细胞有较好的抑制作用，IC50值分别为6.23、3.87和5.63 μM；化合物20和23对K562细胞有较好的抑制作用，IC50值为3.63和5.32 μM；化合物22对SMMC-7721细胞有较好的抑制作用，IC50值为5.35 μM，其作用都与阳性对照相当。酶抑制活性测试结果表明，6个代谢产物对5-脂氧合酶有中等抑制作用，IC50值在1.07-14.57 mM之间；4个化合物对酪氨酸酶有较好的抑制作用，IC50值在0.41-0.94 mM之间，其作用与阳性对照相当；10个化合物对酪氨酸酶有中等抑制作用，IC50值在1.37-15.38 mM之间。另外我们还进行了32株昆虫共生菌三种培养基发酵物的抗菌活性筛选实验，从中筛选出10株共生菌做为拟定研究对象进行抗菌活性物质的深入研究，尤其是编号为FL-F3和FL-F13将作为重点研究对象。通过上述研究结果，进一步发掘了昆虫共生菌潜在的生物合成能力及其产物的医药价值，为微生物资源的持续有效利用提供新的思路。