梅花垂枝候选基因的筛选及其功能研究

Mei（Prunus mume Sieb. et Zucc.）is an specific ornamental woody plant bloomed in early spring, while weeping cultivars of mei own high ornamental and economic value due to its unique tree architecture. At present, the number of weeping cultivar is limited and its breeding through traditional hybridizations is time consuming and inefficient. Revealing the genetic regulation mechanism of weeping trait is crucial to the molecular breeding of weeping cultivars. In the early stage, we constructed the first high-density linkage map of mei utilizing the SLAF-seq strategy, and weeping trait of mei was fine located within 1.14Mb on linkage group 7 of mei. 159 candidate genes are contained in this 1.14Mb area. Due to a poor understanding of the physiological and molecular research background of weeping trait, functional verification of these candidates is time consuming and inefficient. This project aims to further screen weeping candidates by BSR-seq strategy firstly, after that functional verification will be conducted by applying transgenic technology. The expression level and location of the weeping candidates will be analyzed by qRT-PCR and hybridization in situ, and the interacting protein of weeping candidates will be searched through yeast two-hybrid system. At last, molecular regulation network of weeping candidates will be constructed though comprehensive analysis of all these results, which will lay a sound foundation for genetic improvement of weeping trait.

梅花是中国著名的早春开花木本花卉，其垂枝品种树姿独特，具有较高观赏和经济价值。目前垂枝梅花品种较少，而传统杂交育种周期长，效率低，制约了新品种的培育进程。解析垂枝性状的分子调控机理，对于梅花垂枝性状的分子育种十分关键。在前期研究中，我们采用SLAF-Seq技术构建了梅花首张高密度遗传连锁图谱，并首次将控制梅花垂枝性状的位点锁定在7号连锁群1.14Mb区域，该区域共包含159个候选基因，由于目前关于垂枝性状的研究背景较少，使得直接筛选这些基因进行功能验证工作量较大。本项目拟采用BSR-seq方法进一步筛选候选基因并通过转基因技术对其进行功能验证，以荧光定量和原位杂交分析候选基因在枝条不同发育阶段的表达水平和部位，以酵母双杂交实验分离候选基因的互作蛋白，最后综合转基因验证、酵母双杂交以及BSR-seq的转录数据，构建垂枝性状候选基因的分子调控网络，为最终实现观赏植物垂枝性状的遗传改良奠定基础。

垂枝性状近年来受到了广泛的关注，但目前调控垂枝性状建成的机制尚不清楚。本研究以梅花‘六瓣’ב粉台垂枝’F1群体为试验材料，首先测定了垂枝后代和直枝后代枝条的长度、植株的高度及垂枝后代和直枝后代枝条的近轴侧和远轴侧四个混样池的激素含量。并利用混合池转录组测序技术（Bulked segregant RNA-Seq，BSR-Seq）从转录水平比较了垂枝后代枝条和直枝后代枝条的差异。综合以上内容，结合前期垂枝基因定位结果对与垂枝性状相关的候选基因进行了初步筛选，并对候选基因的功能进行了验证及分析。主要研究结果如下：.（1）本研究通过分析垂枝后代和直枝后代代表植株的植株高度和当年生枝条长度，发现垂枝梅和直枝梅的枝条长度及株高均有显著的差异（P<0.01）。垂枝后代的当年生枝条长度为57.65 cm-151.58 cm。而直枝后代的当年生枝条长度为44.83 cm-64.94 cm。另外，直枝后代株高177 cm-245 cm，垂枝后代株高75 cm-141 cm，且直枝后代的株高显著（P<0.01）高于垂枝后代。.（2）激素测量结果显示，两种生长素（IAA、ICA）的含量，四种细胞分裂素（IP、cZ、tZ、DZ）的含量，赤霉素（GA3）的含量和脱落酸（ABA）的含量在垂枝后代枝条和直枝后代枝条间存在显著（P<0.01）的差异。.（3）BSR-Seq分析发现垂枝后代枝条和直枝后代枝条间共32787个SNP位点和477个InDel位点，差异表达基因2208个。GO和KEGG pathway的功能富集分析发现，这些差异基因主要参与了光合作用和黄酮类物质生物合成及代谢相关的生物过程。.（4）结合生理及转录水平垂枝和直枝后代的差异，初步筛选了17个与IAA和GA3生物合成及转运和枝条次生发育相关的垂枝候选基因。结合已有的垂枝性状相关的研究成果，又筛选得到14个可能的垂枝候选基因。.（5）对候选基因在梅花不同组织及不同枝型表达模式进行了分析，结果表明：PmTAC1和PmLazy1在梅花垂枝和直枝上下侧差异表达。在此基础上，进一步构建了TAC1启动子GUS载体及编码区超表载体，并分别转化梅花及拟南芥，目前拟南芥已经获得T2代植株，梅花获得少量阳性苗，相关表型指标正在观测中。