高尔基体在草鱼呼肠孤病毒复制与组装中的作用及分子机制研究

During viral infections, most viruses can use the host organelles to form viral factories and help viral replication and assembly. However, compared with the enveloped viruses, the molecular mechanisms of the non-enveloped viruses remains poorly understood. The non-enveloped double-stranded RNA virus, grass carp reovirus (GCRV), will be used as a research model in this project. And how the nonstructural protein NS80 of GCRV use host organelles to help viral replication and assembly will be studied. At first, immunofluorescence will be used to screen co-localization between NS80 protein and host organelles, such as Golgi. And then bioinformatics analysis and methods will be used to design and construct series of truncated or deletion mutants of NS80. Co-localization assay, Co-immunoprecipitation assay and Western-blot will be used to study the important regions and key amino acids of NS80 that help it to target to Golgi complex. .Finally, the RNA interference or Brefeldin A (BFA) drug treatment will be used to study the role of Golgi in GCRV replication and assembly. This will lay a foundation for elucidating the molecular mechanisms of non-enveloped virus replication and assembly in host cells.

在病毒感染细胞时，大多数病毒能利用宿主的细胞器来形成病毒工厂，帮助其自身的复制与组装。相对于囊膜病毒，目前对无囊膜病毒在细胞中复制与组装的分子机理知之甚少。本项目拟以无囊膜的双链RNA（dsRNA）病毒，草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus, GCRV）为研究模型，探究其非结构蛋白NS80如何利用宿主的细胞器来协助病毒自身的复制与组装。通过免疫荧光筛选与NS80蛋白有共定位的宿主细胞器（如高尔基体等）；采用生物信息学分析方法，设计与构建NS80一系列的截短或缺失突变体，通过荧光共定位以及联合运用免疫共沉淀（Co-IP）和Western-blot技术来研究NS80定位于高尔基体的重要区域以及关键氨基酸；进一步利用RNAi技术或化学药物Brefeldin A（BFA）处理高尔基体，以探索其在GCRV复制与组装中所起的作用；从而为阐明无囊膜病毒复制与组装的分子机制奠定基础。

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的NS80蛋白在单独转染和病毒感染情况下都能在细胞核周围形成球状包涵体结构，是GCRV的病毒加工厂。病毒加工厂的形成和宿主的细胞器存在一定关联，为了研究宿主细胞器以及NS80在GCRV感染和复制中作用，本研究利用免疫荧光技术首先筛选到GCRV的NS80蛋白能与宿主的高尔基体共定位，并且能改变高尔基体的结构。为了研究其分子机制，我们构建了NS80 N端和C端与轮状病毒NSP5融合表达的质粒，免疫荧光的结果表明NS80通过N端的不同区域与病毒的核心结构蛋白VP1、VP4、VP6以及非结构蛋白NS38存在相互作用；通过免疫共沉淀技术证实了NS80的N端不同区域与上述蛋白存在相互作用。为了进一步研究NS80的N端在病毒感染中的作用，通过shRNA干扰NS80的合成，以及转染对shRNA有脱靶效应的全长NS80以及NS80(471-742)的质粒的表达产物分析，结果表明全长的NS80具有回复GCRV病毒感染的能力，但是NS80(471-742)不能拯救GCRV病毒的感染，说明NS80的N端在GCRV病毒复制和感染中起着重要的作用；为了进一步研究宿主高尔基体在病毒复制和感染中的作用，使用高尔基体的抑制剂Brefeldin A(BFA)和Golgicide A(GCA)来抑制和破坏高尔基体的功能，结果表明两种抑制剂都能显著的抑制GCRV病毒的感染，说明宿主的高尔基体在GCRV病毒的复制和感染中起着重要作用。