探讨125I-AFPasON增效siRNA沉默靶基因的RNAi方法

基因二维结构与siRNA沉默效率有关，我们预实验提示适量碘-125标记的AFP反义寡核苷酸(125I-AFPasON)可引起AFP基因构象变化。本研究根据有效沉默AFP的siRNA系列，设计同源asON，标记放射性碘-125。利用共焦激光拉曼光谱技术，分析不同放射性活度的125I-AFPasON，在细胞内、外对AFP基因结构、局部构象及功能键的影响，以及AFP siRNA质粒和125I-AFPasON对HepG2细胞内AFP基因及非特异性基因的 mRNA表达和其蛋白合成，以及细胞凋亡和增殖情况的影响。分析放射性碘-125局部辐射siRNA靶基因靶点，改变局部mRNA构象，暴露siRNA结合位点，对siRNA沉默AFP基因效率的影响，探讨两者联合的多重沉默靶基因的RNA干扰模式，对提高siRNA特异性，减少siRNA用量，弱化siRNA脱靶效应，提高siRNA对靶基因的沉默效率具有重要价值。

研究背景：肝细胞癌（HCC）是一种严重危害健康的原发性恶性肿瘤，各种治疗手段疗效仍有限，治疗的难点主要在于肝癌的高度转移和复发倾向。肝癌基因治疗是近年来研究的热点，然而基因治疗的影响因素较多，疗效仍不满意，核素辐射可引起基因结构变化，可能提高基因干扰效应，局部辐射靶基因，是否提高小分子RNA干扰效率，需要进一步研究提高基因干扰效率。.主要研究内容及方法：本研究根据有效沉默AFP的siRNA系列，设计同源asON，标记放射性碘-125。利用共焦激光拉曼光谱技术，分析不同放射性活度的125I-AFPasON，在细胞内、外对AFP基因结构、局部构象及功能键的影响以及慢病毒转染AFP siRNA联合125I-AFPasON对HepG2细胞内AFP基因的抑制效应。.主要研究结果：1）构建的AFP siRNA能够有效抑制HepG2细胞AFP基因表达，siRNA慢病毒颗粒能够更有效沉默靶基因。2）壳聚糖纳米载体介导的125I-AFPasON转染HepG2细胞的转染率为52.5％。转染辐射HepG2细胞6小时后，可导致靶DNA构象及功能团损伤，24小时后可使靶基因结构破坏及碱基脱落。3）125I辐射可增加反义核苷酸干扰靶基因的抑制效率，特异地降低HepG2细胞AFP基因及蛋白表达。74kBq/µl的125I-AFPasON，可有效地影响AFP靶基因的结构及功能，抑制AFP基因的表达及其蛋白的合成，达到特异地靶基因干扰效应，而又没有导致大量的细胞凋亡等脱靶生物效应。但是，随着辐射剂量增加到一定程度，则可导致显著的靶细胞凋亡发生。4）慢病毒转染siRNA联合壳聚糖纳米转染125I-AFPasON对AFP基因的抑制率为93.0%，显著高于siRNA没有辐射对AFP基因的抑制效果（抑制率为71.4%），p<0.05, 效率提高30％以上。.结论及研究意义：反义基因携带125I局部辐射靶基因，改变靶基因局部mRNA构象，局部辐射与siRNA联合作用靶基因，提高siRNA对靶基因的沉默效率。本研究探讨两者联合的多重作用靶基因的RNA干扰模式，对提高siRNA特异性，减少siRNA用量，弱化siRNA脱靶效应，提高siRNA对靶基因的沉默效率具有重要价值。