基于内源siRNA的东方百合花青素合成途径的转录后沉默机制研究

Flower color is one of the most important quality traits for ornamental plants. Anthocyanins are the most important pigments for flower coloration and the target molecular for color modification in flower breeding. Oriental hybrid lilies with the variety of anthocyanin are good materials to study anthocyanin metabolic mechanism. Base on the strong preliminary work, we are struggling to uncover post-transcriptional gene silencing (PTGS) of anthocyanin synthase pathway caused by endogenous siRNA with white ‘Siberia’ and pink ‘Sorbonne’. Analyze the tepal pigments using HPLC and build the relation between anthocyanin and flower color. Identify the structure gens and regulatory genes in anthocyanin synthase pathway. Determine the expression pattern of those genes in nine developmental stages of tepal with different color using qRT-PCR and find the key candidate genes. Analyze the protein-DNA interaction between transcription factors (MYB and bHLH) and promoters of candidate gens. Compare the expression level of candidate gene pre-mRNA and mature-mRNA to confirm the occurrence of PTGS of candidate genes during the coloration process. Through small-RNA sequencing, screen the siRNAs causing PTGS of candidate genes. And confirm the function of candidate gene siRNAs during the tepal coloration by VIGS and genetic transformation with stable gene interference. This project will uncover a new regulation mechanism on anthocyanin synthase pathway and provide guidance to color modification in molecular breeding of lilies.

花色是观赏花卉主要品质性状之一，花青素苷是花色形成的主要色素类群之一，是花色改良的主要调控物质。东方百合花青素苷含量在品种间存在显著差异，是探讨植物花青素苷代谢机制的良好试材。本项目在前期研究基础上，选择东方百合粉色品种‘索邦’和白色品种‘西伯利亚’，研究siRNA介导的花青素苷合成途径的转录后沉默机制。测定各样本色素成分和含量并分析其与花色表型的关系；分离花青素苷合成相关的结构基因和调节基因，分析其在呈色过程中的表达模式，筛选关键的差异表达基因；分析差异基因启动子与转录因子的互作关系；比较前体mRNA和成熟mRNA丰度并进行Northern杂交分析，证明差异基因发生转录后沉默过程；利用小RNA测序，筛选出差异基因的siRNA；利用VIGS系统和稳定的基因干扰株系，验证siRNA的功能。本项目研究对阐明百合花被片花青素苷合成途径的表达调控机制有重要意义，也为百合花色改良的分子育种提供依据。

花色是观赏花卉主要品质性状之一，花青素苷是花色形成的主要色素类群之一，是花色改良的主要调控物质。东方百合花青素苷含量在品种间存在显著差异，是探讨植物花青素苷代谢机制的良好试材。本项目以东方百合粉色品种‘索邦’和白色品种‘西伯利亚’为研究材料，花被片解剖观测表明，西伯利亚中无可见色素分布，索邦中可见色素不均匀分布。UPLC-MS/MS分析结果显示，是否含有花青素类物质决定了两个百合品种花色性状的差异。克隆了两个品种中花青素合成通路中的结构基因和转录因子，两个品种的序列高度相似，不是花色差异的原因。在转录组测序结果基础上比较这些基因在两个品种花被片发育中的表达变化，发现CHS、F3’H和MYB12是关键的差异基因。小RNA组和转录组的联合分析表明，有9个差异表达的miRNA靶向7个花青素相关基因（包含了MYB12、F3’H、ANS等），西伯利亚中上调的siRNA与下调的转录本（CHS，DFR和FLS）高度相关。酵母双杂交试验表明，MYB12的R3结构域是与bHLH2发生蛋白互作必须的。在烟草和拟南芥中过量表达MYB12，均强烈诱导花青素的大量合成，在茎、叶、花中花青素苷含量显著提高。本项目研究对阐明百合花被片花青素苷合成途径的表达调控机制有重要意义，也为百合花色改良的分子育种提供依据。