ERF转录调控柑橘果实萜类芳香物质形成的机制

Aroma is an important characteristic of fruit quality. Fruit growth and development are accompanied with formation, conversion and accumulation of aroma compounds. Citrus has strong aroma and it is a major fruit in China. Previous studies showed that terpenes were the major aroma volatiles in citrus, despite fruit species, cultivars, or fruit maturity, and their biosynthesis was regulated by plant phytohormone ethylene. However, the underlying regulatory mechanisms of ethylene signal transduction on fruit aroma were rarely investigated. Ethylene response factors (ERFs) interact with target genes directly and are important elements to fulfill the biological function of ethylene. Therefore, transcriptional regulation of ERF will be an important breach in understanding aroma formations in citrus fruit. By using citrus fruit at different developmental stages as materials, the present project will focus on transcriptional regulation of ERF in formation of aroma compounds in citrus fruit. Combined technologies, including chromatography, physiology and biochemistry, molecular biology will be utilized to investigate the regulatory effect of ethylene on aroma formation and to identify key ERF gene(s) and terpene synthase genes (TPSs) involved in aroma formation. Further regulation mechanism of interaction between ERF(s) and TPS(s) will confirmed by transient assay and transgenic study. The results of present project will provide new insight in transcriptional regulatory of aroma formation in citrus fruit and provide new scientific evidence for improving fruit aroma quality.

芳香物质是果实重要特征品质指标，已成为发育与品质研究新主题。柑橘是我国重要果树种类，其果实芳香浓郁。我们前期对不同种类、品种、生长发育阶段柑橘果实开展了芳香物质组分的研究，发现柑橘果实主要芳香物质是萜类物质，它们的形成与转变受乙烯调控，但是基于信号转导途径的果实芳香物质形成的调控机制尚不清楚；转录因子ERFs可直接调控目标基因表达，是实现乙烯生物学效应的关键元件，因此它也是开展果实芳香物质形成机制的重要调控位点。本申请项目以不同发育阶段的柑橘果实为材料，围绕果实生长发育过程中芳香物质合成的分子调控机制，应用色谱化学、生理生化和分子生物学等技术手段，明确乙烯对生长发育果实特征芳香物质形成的调控效应，鉴别参与特征芳香物质代谢调控的ERFs基因家族成员，阐明ERFs与萜类合成酶的互作模式并验证其功能，进而阐明芳香品质形成的乙烯转录调控机制，为改善果实品质提供依据。

对于果实而言，香气物质具有重要的生物学功能，既可以吸引消费利于种子传播，也可以作为重要的风味和营养品质组成。作为重要的经济果树，柑橘果实香味浓郁，主要来自于挥发性的萜类物质。在这些萜类物质中，单萜的香叶醇和倍半萜的瓦伦烯对于柑橘果实的香气具有重要作用。尽管很早就知道了上述物质对于柑橘果实香气品质形成的重要性，然而相关的萜类合成酶TPS基因家族成员并未得到鉴别。已有研究显示，转录因子对于棉花和玉米等植物中的次生代谢产物萜类物质具有转录调控的效果，为进一步开展果实中萜类香气物质的调控分子机制研究提供了线索。利用柑橘的基因组数据库，开展了纽荷尔甜橙果实的TPS基因家族成员克隆与表达研究，初步筛选候选家族成员。利用体外原核表达和体内同源瞬时表达技术体系，发现CsTPS1参与倍半萜的瓦伦烯生物合成，而CsTPS16则参与了单萜的香叶醇合成。为了进一步了解上述TPS基因的调控机制，开展了转录因子的筛选。研究发现，柑橘果实中至少存在转录因子AP2/ERF的56个基因家族成员，它们在果实成熟过程中具有表达，可能参与了果实发育和品质形成。基因表达结果显示，CitAP2.10同瓦伦烯含量变化有关，同CsTPS1表达具有相似性。采用乙烯处理加速了甜橙果实的CitAP2.10和CsTPS1表达，并促进了瓦伦烯积累，采用乙烯作用抑制剂1-MCP则抑制了CitAP2.10和CsTPS1表达以及瓦伦烯的含量。烟草双荧光素酶分析发现CitAP2.10可以转录激活CsTPS1表达。在甜橙果实中过量表达CitAP2.10显著促进了瓦伦烯的含量增加。上述结果表明，转录因子AP2/ERF成员CitAP2.10参与了甜橙果实瓦伦烯生物合成的转录调控。利用相似的研究策略，EMSA分析发现CsERF71可以直接结合CsTPS16启动子，酵母单杂结果进一步验证了这个结果，并且的烟草的双荧光素酶分析显示CsERF71可以转录激活该CsTPS16的表达。上述研究发现初步揭示了甜橙果实单萜和倍半萜香气物质转录调控的分子机制，表明植物的转录因子AP2ERF在调控果实香气品质形成方面具有重要作用。