登革病毒包装过程中衣壳蛋白与RNA遗传学相互作用

登革病毒（DENV）属于黄病毒属，是目前热带亚热带发病最多、危害最大的虫媒病毒之一，迄今尚无有效的疫苗和药物。DENV衣壳蛋白与RNA的相互作用对于病毒包装起着关键作用，但具体分子机制仍不清楚。该方面的研究将为DENV疫苗设计和抗病毒药物筛选提供新的思路和潜在的作用靶点。本研究拟借助于反向遗传学平台，通过传代驯化实现异源日本脑炎病毒（JEV）衣壳蛋白对DENV-2基因组RNA的有效包装，并对其进行全基因组测序、比对及VLP反式包装验证等，鉴定出衣壳蛋白与RNA之间可能的作用位点和包装信号序列。进一步通过JEV和DENV衣壳蛋白的序列结构比对分析，在DENV中进行回归分析验证，并结合RNA二级结构分析，揭示DENV包装过程中衣壳蛋白与RNA之间遗传学相互作用，为抗病毒药物筛选和疫苗研制提供理论依据，为探索其它黄病毒包装机制提供借鉴。

登革病毒（DENV）属于黄病毒属病毒，其引起的疾病主要为登革热和登革出血热，是重要虫媒病毒之一。黄病毒属还包含有乙型脑炎病毒（JEV）、黄热病毒（YFV）、森林脑炎病毒（TBEV）等其他重要的人类致病病毒。研究DENV病毒衣壳蛋白与RNA的相互作用，对了解黄病毒包装机制具有重要意义，可为抗病毒药物筛选提供新的思路和潜在的作用靶点。本研究借助于乙型脑炎病毒和登革病毒的反向遗传学平台，构建了不同杂合病毒，实现了异源衣壳蛋白对病毒基因组RNA的有效包装，并在此基础上，发现并初步阐明了病毒衣壳蛋白上包装基因组RNA的关键位点和作用机制。整个项目执行期间共计发表文章SCI论文8篇，培养博士生3名。.主要研究成果具体如下：.1）建立了JEV病毒的感染性克隆、复制子和假病毒粒子（VLP）包装等反向遗传学工具，能够在实验室大量产生遗传学上均一的重组病毒，实现了对JEV病毒的遗传学操作，可以对病毒的不同位点进行突变并研究其生物学功能；利用JEV复制子可以通过对报告基因的检测实现对病毒基因组RNA的复制情况进行定量分析；利用VLP包装系统可以研究结构蛋白对病毒基因组RNA的包装。.2）利用DENV的感染性克隆，建立了一系列不同的DENV-WNV杂合病毒，发现含有prME或者成熟capsid的杂合病毒均可以有效的产生重组病毒，并且初步证明衣壳蛋白（capsid）在病毒包装过程中可能不具有种属特异性；通过对杂合病毒进行传代，我们发现envelope蛋白上的15位氨基酸Val→Ile的突变（E-V15I）可以改变病毒噬斑的大小，提高prME杂合病毒的产毒效率；capsid杂合病毒上的capsid-A101C突变和5’UTR核苷酸突变T78G均可以显著提高病毒基因组RNA的复制，而没有影响病毒的包装。.3）在此研究过程中，我们还证明了NS2b（T102M）蛋白的跨膜区能够通过蛋白酶活性非依赖的方式来影响病毒的复制，同时在对NS4a-K79R突变病毒进行遗传分析时，我们还发现在另一重要膜蛋白NS4b上出现的适应性突变NS4b-Y3N能够回复NS4a-K79R突变对病毒复制的影响，从而首次证明NS4a和NS4b之间存在遗传学相互作用，并且它们之间的相互作用在病毒复制过程中发挥着重要功能。