枸杞WRKY类转录因子对果实品质形成调控机制研究

Gouqizi, a well-known traditional Chinese medicinal plant,is commonly known as Goji berry or wolfberry. The sugar plays a vital role in fruit development and response to environmental challenges, but the complex molecular mechanism of fruit metabolism regulation is poorly understood. "Ningqi No. 1" is chosen as experimental material. We will use the 454 GS FLX Platform and Titanium regents to produce a substantial expressed sequenee tag (EST) dataset from the fruit of Lycium barbarum L. The full length the cDNAs of 5-8 putative WRKY fruit will be isolated from Lycium barbarum L.. The structure, subcullar localization and its binding to W-box and its expression pattern will be analyzed. Their functions will be studied by transient expression, real time PCR and over expression in transgenic Arabidopsis thaliana and Lycium barbarum L. These results will establish an essential resource for understanding metabolite biosynthesis of fruit. This study will lay the foundation for the research of the transcription factors regulate gene expression and will lead to better utilization and development of Lycium barbarum L. in the future.

枸杞是我国传统的名贵中药材，其药用品质主要取决于果实中糖分含量和种类，生理学研究表明枸杞果实的品质与环境条件、栽培条件等密切相关，然而其药用品质形成的分子机制知之甚少。本项目拟以宁杞1号为材料，利用高通量454 GX FLX测序技术，获得不同发育时期枸杞果实的转录谱，挖掘枸杞中的WRKY类转录因子，对其中5-8个WRKY转录因子基因进行转录激活活性、核定位分析，并进一步研究WRKY基因上游调控序列应答元件，获取启动子表达信息；分析不同组织、不同生态因子、不同栽培措施下枸杞WRKY基因的表达调控特性；通过农杆菌转化拟南芥、枸杞，确定其生物学功能，获得改良品质的枸杞新品系。揭示WRKY类转录因子对枸杞果实品质形成的调控机理，为深入理解转录因子的调控机制积累资料，为提高枸杞果实的产量和质量提供一些新的切入点，为形成高效的栽培措施提供理论依据，推动这一药食两用植物资源的保护、开发、利用。

枸杞是重要的药食同源园艺作物，果实发育过程决定了枸杞的产量和品质。WRKY转录因子调控植物发育，本项目针对枸杞果实形成分子机制了解甚少之现状，以宁杞1号为材料，明确了WRKY 转录因子在枸杞果实发育中所起的作用及其分子调控机制，有助于更好的理解果实发育过程中信号转导及调控，为解决枸杞生产中存在的问题提供理论依据。通过构建枸杞cDNA文库，获取果实转录表达谱信息，克隆了6个枸杞WRKY 家族基因，重点研究了枸杞LbWRKY2和LbWRKY3的功能及其在信号转导中的作用，所得结论主要如下：.（1）构建了枸杞果实cDNA文库，共获得53,175条Unigenes，其1kb以上Unigenes 12,569条，SSR标记2,686个。 对29,045条Unigenes进行生物信息学注释， 获得4,084个差异表达基因。.（2）克隆了 6个全长 WRKY 转录因子基因：Lb WRKY1-Lb WRKY6，其全长序列包括：长度范围为1441-1344 bp 的ORF、不同长度 的 5’UTR、3’UTR及 poly+（A）。 其ORF区均含有典型的WRKY7个蛋白保守domain，分属于 WRKY 转录因子第I、 II 类家族；与马铃薯WRKY7、甜瓜WRKY4、番茄WRKY1、烟草WRKY与其同源性较高，分别为 91%、88%、84%，79%。.（3）Lb WRKY基因表达模式存在很大差异：Lb WRKY1、Lb WRKY4、Lb WRKY6主要在枸杞果肉和果皮中表达高，而在叶和根表达较少，说明其在枸杞果实发育过程中起调控作用，Lb WRKY2、Lb WRKY3、Lb WRKY5在枸杞根表达最高，而在叶和果肉和果皮中表达较少能主要参与果实中碳水化合物的分配。.（4）构建了Lb WRKY与绿色荧光蛋白融合表达载体，检测GFP 融合蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达发现：LbWRKY1、LbWRKY2、LbWRKY4及LbWRKY6蛋白存在于细胞核中，LbWRKY3和LbWRKY5则定位在细胞质。在大肠杆菌中诱导表达了LbWRKY2 和LbWRKY3蛋白。.（5）构建了过表达载体和干扰表达载体，成功转化拟南芥、枸杞。LbWRKY2、 LbWRKY3过表达转基因植株抗旱表型明显。干旱胁迫后LbWRKY2、 LbWRKY3过表达转基因植株与野生型相比存活率提高 35%、50%